兔外伤性增生性玻璃体视网膜病变中碱性成纤维细胞生长因子和增殖细胞核抗原表达的变

作者                 作者单位

游江   中南大学湘雅二医院 眼科，湖南 长沙 410011

姜德咏 中南大学湘雅二医院 眼科，湖南 长沙 410011

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)作为一种强有力的促细胞增殖、分化和存活的营养生长因子，与肿瘤、胚胎发育、变性、以及血管异常性病变等疾病间的关系，已被生物医学界广泛研究[2-3]。bFGF作为参与PVR形成的主要细胞因子之一，已受到越来越多的重视。本实验分别采用原位杂交和免疫组化方法检测bFGF mRNA和PCNA在兔外伤性增生性玻璃体视网膜病变的表达，观察其动态变化。

1 材料与方法

1.1 富含血小板血浆(platelet rich plasma，PRP)制备 以5 ml注射器抽取耳动脉血5 ml，1500 r/min离心5 min，制备富含血小板的血浆，血小板计数器测定血浆中血小板数量为(2.24~2.71)×108/ml。

1.2 外伤性实验性PVR模型制作 成年有色兔，体重1.5~2.5 kg，雌雄不限，静脉注射乌拉坦麻醉剂3~4 ml/kg，每只兔选右眼作为实验眼，分离3~9点的球结膜和筋膜，在角膜缘后2 mm处用剃须刀刺向玻璃体中心部，勿伤及晶状体及周边视网膜，用剪刀向两侧扩大切口，伤口与视网膜平行，达8 mm，轻压眼球，将脱出的玻璃体剪除，用8-0尼龙线间断缝合切口，检查眼底排除眼内出血及视网膜脱离。用1 ml注射器抽取0.4 ml富含血小板血浆注入玻璃体内制备眼外伤模型。

1.3 成年有色兔6只，制模后于第1、第3、第5、第7、第10、第14和第28天在充分散瞳的情况下用直接检眼镜检查眼底情况，采用Fastenberg分级方法(0~5级)进行PVR分级。

1.4 光学显微镜检查 第28天时处死动物，取出眼球，经4%多聚甲醛固定液固定24 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡和石蜡包埋后进行切片，片厚5 ?滋m，贴于经多聚赖氨酸处理的载玻片上，常规进行HE染色、显微镜观察。

1.5 眼球标本制作 成年有色兔8只，于制模后第7、第14、第21、第28天分别将2只模型兔过量麻醉处死，迅速摘除眼球，固定24 h，梯度酒精脱水， 二甲苯透明，浸蜡和石蜡包埋后进行切片，片厚4 ?滋m，贴于经多聚赖氨酸处理的载玻片上。

1.6 bFGF mRNA检测 按bFGF mRNA原位杂交试剂盒说明进行操作：切片脱蜡，细胞打孔，加消化液，预杂交，杂交，加抗体，加过氧化物酶链亲和素，DAB显色，复染，脱水，封片。

1.7 PCNA检测 按PCNA免疫组化试剂盒说明进行操作：切片脱蜡，灭活内源性酶，热修原抗原，加PCNA抗体，加抗小鼠IgG，加SABC试剂，DAB显色，复染，脱水，透明，封片。

1.8 图像分析 应用Image-Pro Plus图像分析系统，在400倍视野下，每张切片随机选取5个视野，对bFGF mRNA原位杂交及PCNA免疫组化染色结果进行分析，计算平均积分光密度。

1.9 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件包进行统计分析。不同时间点的bFGF mRNA及PCNA表达的统计分析采用方差分析，两者之间的关系采用Pearson相关分析。

2 结果

2.1 临床观察结果 所有实验动物在实验观察期间结膜及角膜上皮无溃疡、糜烂缺损。模型制备后玻璃体腔内立即出现灰白色混浊团，混浊与伤道相连。伤后第1天，玻璃体混浊加重，范围扩大。伤后第3天，玻璃体混浊继续加重，部分出现纱幕样玻璃体混浊，可见灰白色的玻璃体条索形成。伤后第7天，玻璃体混浊开始减轻，玻璃体条索逐渐增粗、增长，自伤口方向指向后极部、视盘及髓线。伤后第10天开始，玻璃体条索增粗、增长，并牵拉视盘及髓线，开始出现局部视网膜脱离及髓线视网膜皱褶。伤后第14天，牵引性视网膜脱离数量增加。伤后第28天，5眼均发生广泛或漏斗状视网膜脱离。各观察时间点眼底检查PVR分级情况见表1和图1~图3。光学显微镜检显示玻璃体视网膜增生明显，视网膜脱离发生与临床检查结果基本一致(见图4)。

2.2 外伤性PVR模型视网膜组织bFGF mRNA表达呈现先升高后降低的动态变化(见表2)，在制模后第14天达到峰值，与第7、第21、第28天时比较，差异有显著性(F=10.994，P<0.05)。

2.3 外伤性PVR模型视网膜组织PCNA表达呈现先升高后降低的动态变化(见表2)，在制模后第14 天达到峰值，与第7、第21、第28天时比较，差异有显著性(F=27.051，P<0.05)。

2.4 经Pearson相关分析，外伤性PVR模型视网膜组织bFGF mRNA和PCNA表达之间在0.01水平上显著相关(r=0.580)。

3 讨论

bFGF是一种阳离子多肽，在体内对内皮细胞有趋化和促有丝分裂作用，能介导神经元的分化、存活和再生，刺激神经胶质细胞移行;参与细胞过度增生和血管过度形成所引起的多种病理损害[4]。眼内多种细胞包括晶状体上皮细胞、小梁细胞、Müller细胞、视网膜色素上皮细胞和光感受器间基质等均表达成纤维细胞生长因子(FGF)。人RPE细胞上bFGF的受体主要为成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)[5]，bFGF可与之结合，表现其强大的生物学功能。周浩等[6]经实验证实，bFGF能促进RPE细胞的再生和修复。朱晓波等[7]报道，bFGF不仅刺激RPE细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞的有丝分裂，还可刺激成纤维细胞产生胶原，调控细胞外基质的合成及降解，促进损伤修复。

Cassidy等[8]研究发现，在伴有PVR的视网膜脱离患者玻璃体液中bFGF含量增高，而不伴PVR的视网膜脱离患者玻璃体液中bFGF含量无增高。Kon等[9]发现，PVR患者玻璃体bFGF水平显著高于没有PVR者，而且在术后发生PVR者较未发生PVR者玻璃体中bFGF水平显著升高。

Liang等[10]通过对21例PVR增生膜的研究发现，其中14例增生膜中有bFGF表达，而且bFGF更多的是出现在细胞外基质的富含细胞区，因此认为视网膜增生膜中的细胞具有合成和分泌bFGF的能力， 而且生长因子可能是通过增殖细胞的自分泌或旁分泌方式产生的。

Westra等[11]通过对外伤性牵引性视网膜脱离模型的研究发现，在制模后6 h和24 h，增殖膜和外伤部位未检测到bFGF的表达，在制模后7、17、28 d时，增殖膜可检测到bFGF的表达。

增殖细胞核抗原(PCNA)是一种仅在增殖细胞中合成表达的核内多肽，是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，是DNA复制和修复的必需物质，为多种丝裂原信号最后传导通路[12]。PCNA表达和合成与细胞周期有关，故亦称为周期素(Cyclin)。PCNA在细胞中表达的多寡已被广泛地用以衡量细胞增殖状况的检测指标。

在实验中我们观察到，外伤性PVR阴性对照组视网膜组织bFGF mRNA表达呈现先升高后降低的动态变化。制模后第1周，PVR处于炎症期阶段，第7天时视网膜组织bFGF mRNA表达呈弱阳性;第2~3周，PVR处于增殖期阶段，第14天时视网膜组织bFGF mRNA表达明显增强为强阳性，达到峰值，与第7、第28天时比较差异具有显著性(P<0.05)，第21天时视网膜组织bFGF mRNA表达仍维持在高水平，但较第14天时稍有回落;第28天时，PVR进入到瘢痕期阶段，视网膜组织bFGF mRNA表达出现大幅回落。根据实验结果，我们认为在外伤性PVR形成的3个阶段中，bFGF的产生、分泌呈现先升高后降低的波动，高峰期出现在增殖期阶段，其参与调控PVR形成的关键时期即为增殖期，与以往的文献报道一致[11]。

经Pearson相关分析，我们发现bFGF和PCNA表达之间在0.01水平上显著相关，说明bFGF参与外伤性PVR增殖细胞的生长调控，与细胞增殖的动态变化显著相关。

【参考文献】

[1] 张诚玥，李根林. 增生性玻璃体视网膜病变中细胞因子的作用[J]. 国外医学 眼科学分册，2005，29(6)：407-411.

[2] 周咏东. bFGF影响凋亡的分子机制及其在眼科的研究[J]. 国外医学 眼科学分册，2002，26(1)：50-54.

[3] Bikfalvi A， Klein S， Pintucci G， Rifkin DB. Biological roles of fibroblast growth factor-2[J]. Endocr Rev，1997，18(1)：26-45.

[4] 赵世红，何守志. 碱性成纤维细胞生长因子及其受体FGFR1在脉络膜新生血管中的表达[J]. 眼科研究，2003，21(3)：234-237.

[5] Guillonneau X， Tassin J， Berrou E， et al. In vitro changes in plasma membrane heparan sulfate proteoglycans and in perlecan expression participate in the regulation of fibroblast growth factor 2 mitogenic activity[J]. J Cell Physiol，1996，166(1)：170-187.

[6] 周浩，周韵秋，奚寿增，等. 碱性成纤维细胞生长因子对兔视网膜激光损伤愈合的促进作用[J]. 中华眼科杂志，2001，37(2)：144-145.

[7] 朱晓波，唐仕波，罗燕，舒拉明对碱性成纤维细胞生长因子促进人视网膜色素上皮细胞增殖作用拮抗效应的研究[J]. 中华眼科杂志，2005，41(2)：110-113.

[8] Cassidy L， Barry P， Shaw C， et al. Platelet derived growth factor and fibroblast growth factor basic levels in the vitreous of patients with vitreoretinal disorders[J]. Br J Ophthalmol， 1998，82(2)：181-185.

[9] Kon CH， Occleston NL， Aylward GW， et al. Expression of vitreous cytokines in proliferative vitreoretinopathy[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，1999，40(3)：705-712.

[10] Liang X， Li C， Li Y， et al. Platelet-derived growth factor and basic fibroblast growth factor immunolocalized in proliferative retinal diseases[J]. Chin Med J (Engl)， 2000，113(2)：144-147.

[11] Westra I， Robbins SG， Wilson DJ， et al. Time course of growth factor staining in a rabbit model of traumatic tractional retinal detachment[J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol， 1995，233(9)：573-581.

[12] 翁景宁，张惠蓉. 碱性成纤维细胞生长因子诱导牛晶状体上皮细胞增殖细胞核抗原的表达及对晶状体上皮细胞增殖作用的研究 [J]. 中华眼科杂志，2002，38(3)：176-1791.