糖尿病对大鼠睾丸病理变化及睾酮合成、17β-HSD3和3β-HSD1mRNA表达的影响

作者           作者单位

林刻智 温州医学院，浙江 温州 325000

王文艳 温州医学院，浙江 温州 325000

肖艳   温州医学院，浙江 温州 325000

王蓉蓉 温州医学院，浙江 温州 325000

方周溪 温州医学院，浙江 温州 325000

陈国荣 温州医学院，浙江 温州 325000

The pathological changes and testosterone synthesis，expression of 17β-HSD3 mRNA and 3β-HSD1 mRNA

in testes from diabetic rats LIN Ke-zhi*，WANG Wen-yan，XIAO Yan，WANG Rong-rong，FANG Zhou-xi，CHEN Guo-rong. *Medical Experimental Teaching Center，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Abstract: Objective: To study the major pathological change of testis，the change of testosterone synthesis function of interstitial cell (Leydig cell) and the expression of 17β-HSD3 mRNA and 3β-HSD1 mRNA in diabetic rat. Methods: Nineteen male Sprague-Dauley rats were divided randomly into two groups: normal control group and diabetic group. The diabetic group was fed with high-fat diet and injected with strepozotocin intraperitoneally to induce type 2 diabetes mellitus. Twelve weeks later，the rats were sacrificed. The morphologic change of testicular tissue was observed under light microscopy (LM) and transmission electron microscopy (TEM)，respectively. The mRNA expression level of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 3(17β-HSD3)and 3β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1(3β-HSD1)of testicular tissue were detected by RT-PCR，the serum testosterone (T) concentration was measured by ELISA. Results: The number of spermatogenic cell in seminiferous tubule was decreased and germinal arrest. Under LM， the Leydig cells were diminished and the nuclear was shrinked in diabetic group. Ultrastructural analysis of Leydig cells by TEM showed dilatation of the endoplasmic reticulum and mitochondrial swelling，and the chromatin was highly condensed in diabetic group. The mRNA levels of 17β-HSD3 and 3β-HSD1 of testicular tissue and the serum testosterone concentrations decreased in diabetic group compared with normal control group. Conclusion: Diabetes can cause morphologic change of Leydig cells and decrease T production. The decreasing mRNA expression of 17β-HSD3 and 3β-HSD1 may be involved in it.

Key words: diabetes mellitus;testis;Leydig cells;testosterone;17β-HSD3;3β-HSD1

间质细胞(Leydig细胞)产生睾酮和曲细精管生精是睾丸的两大主要生理功能，前者制约后者。Leydig细胞是成年雄性动物睾酮的主要来源细胞，其功能状态影响动物的精子发生和性功能[1]。睾丸合成过程中，17β-HSD3、3β-HSD1催化脱氢异雄酮形成睾酮[2，3]。有研究表明，糖尿病大鼠睾丸间质细胞功能障碍，睾酮的合成及分泌降低[4-6]，但其机制尚未明了。本实验通过光镜和电镜观察糖尿病大鼠睾丸间质细胞的病理改变，同时测定并分析睾丸组织17β-HSD3及 3β-HSD1 mRNA含量及血清中睾酮含量变化，以对其机制进行探讨。

1 材料和方法

1.1 动物分组及处理 雄性SD大鼠19只(由温州医学院实验动物中心提供)，体重180～220 g，鼠龄2 个月。随机分组：①2型糖尿病 (DM) 组9只，予高糖高脂饲料(饲料组成：10.0%猪油，20.0%蔗糖，2.5%胆固醇，1.0%胆酸盐，66.5%常规饲料)饲养1个月后，按25 mg/kg剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(厦门星隆达化学试剂有限公司产品，溶于0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液内，pH=4.0)，注射前禁食12 h，注射后72 h空腹血糖≥8.0 mmol/L为模型成功。②正常对照 (NC)组10只，喂以普通饲料，腹腔内注射等容积枸橼酸缓冲液。此后，DM组继续给以高糖高脂饮食，NC组给以普通饮食，12周后处死。

1.2 血清睾酮测定 股动脉放血处死大鼠，各取血3 ml，2000 r/min离心15 min，吸取上清液置-30 ℃冰箱保存，用酶联免疫吸附法测定睾酮含量。

1.3 光镜标本的制备 剪开阴囊，暴露睾丸，每只大鼠左睾丸白膜下用2.5%戊二醛原位固定0.5 h后，横切面剖开睾丸切成3 mm薄片，置于10%中性福尔马林液中固定，经常规乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制作切片，厚3μm，HE染色，中性树胶封固。每个睾丸观察10个低倍视野。

1.4 电镜标本的制备 上述白膜下原位固定0.5 h后的睾丸，切成1 mm×1 mm×1 mm小块，迅速置2.5%戊二醛4 ℃固定l h，锇酸后固定，常规PBS漂洗、丙酮梯度脱水，Epon812包埋，RMC-XL型超薄切片机切片，铅铀双重染色，于H-7500型透射电镜下观察。

1.5 RT-PCR 取右侧睾丸新鲜组织100 mg加1ml Triol(美国Invitrogen公司)，提取各组大鼠睾丸组织的总RNA。取2μg总RNA，用Promega逆转录试剂盒合成cDNA。取1μl cDNA为模板，在Taq DNA 聚合酶(ProbeGene公司)催化下应用特异性引物行PCR扩增。引物设计参照Gene Bank中17β-HSD3，3β-HSD1 mRNA，RPS16 mRNA(作为内参照)序列，由上海Invitrogen公司合成。所有PCR反应条件均标准化，使PCR产物位于线形扩增区。PCR引物及反应条件见表1。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳(含0.5μg/ml Goldview)，Gel-pro凝胶分析系统进行分析，以目的基因和内参照RPS16吸光度的比值来表示相对含量。

1.6 统计学处理方法 采用t检验，方差不齐时用秩和检验。

2 结果

2.1 光镜观察 与正常组对比观察发现，DM组大鼠曲细精管管壁上生精细胞数量减少，管腔内精子极少甚至无法寻及，个别曲细精管仅见紧靠基膜的支持细胞及精原细胞，而其余各级生精细胞及精子消失(见图1)。曲细精管内生精细胞部分或全部脱落，阻塞于管腔内，或生精细胞排列紊乱(见图2)。上述病变在糖尿病组大鼠睾丸内呈多灶性或弥漫性分布。正常大鼠Leydig 细胞在曲细精管间呈簇状分布，多呈菱形或三角形，细胞大，胞浆丰富;细胞核呈圆形或卵圆形，核内染色质呈均匀分布(见图3)。糖尿病大鼠 Leydig细胞仍呈簇分布于间质区，细胞数目无明显减少，细胞多呈圆形或卵圆形且较正常组缩小，胞浆减少，细胞核皱缩，染色质浓集，深染(见图4)。

2.2 电镜观察 正常大鼠Leydig细胞呈菱形，胞质内有丰富的滑面和粗面内质网、高尔基复合体及含有丰富嵴的线粒体，可见少量脂滴;细胞核呈圆形，染色质均匀分布于核周边，可见核仁(见图5)。糖尿病大鼠Leydig细胞多呈圆形，体积缩小，胞质内线粒体扩张，结构不清，嵴消失;内质网扩张，呈空泡样;细胞核皱缩，呈圆形，核膜增厚，染色质呈块状聚集，核仁不清(见图6)。

2.3 血清睾酮测定 DM组血清睾酮水平低于对照组，见表2。

2.4 17β-HSD3、3β-HSD1 mRNA的表达 睾丸组织3β-HSD1 mRNA含量DM组明显低于NC组(P <0.05)，17β-HSD3 mRNA含量两组差异无显著性，结果见表2、图7和图8。

3 讨论

糖尿病时，糖基化终末产物大量形成，其通过氧自由基在糖尿病并发症的发生发展中起着核心的作用[6]。睾丸组织受到氧自由基损伤，表现为SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶活性下降，脂质过氧化增强及血浆睾丸酮水平之下降[13]。近年研究认为，糖尿病雄性生殖与性功能障碍不仅与睾丸支持细胞受损、脂质过氧化作用及NO所致的损伤有关[7]，而且与Leydig细胞结构功能障碍有关[4]。Leydig细胞主要的生理功能是合成分泌睾酮，后者是维持雄性性与生殖功能的最重要的雄激素之一，因此血清睾酮水平可以间接反应睾丸Leydig细胞的功能状态。且Leydig细胞具有分泌类固醇激素的细胞结构特点：滑面内质网丰富，具有很大的表面面积，有丰富的合成胆固醇的酶，因此滑面内质网的发达程度往往反映leydig细胞合成雄激素的功能状态，并且leydig细胞内的线粒体大而丰富，呈多形性，富于脂肪酸β氧化酶系。所以Leydig细胞结构变化必将影响其睾酮合成分泌的功能[8-10]。本实验中，我们观察到糖尿病大鼠睾丸Leydig 细胞线粒体扩张、变形、结构不清，嵴消失，滑面内质网减少及扩张，呈空泡样;细胞核皱缩，染色质呈块状聚集，核仁不清，Leydig 细胞数量减少，生精阻滞等形态学改变的同时，发现DM组血清睾酮水平明显降低，可认为糖尿病导致Leydig细胞结构功能受损。

胆固醇转变为有生物活性的睾酮是一个多步酶促反应过程，在这个过程中17β-HSD3、3β-HSD1 mRNA催化脱氢异雄酮到睾酮的转变，促进睾酮的最后合成[2，3]。因此,睾丸间质细胞合成T过程中的关键酶表达降低的直接后果必然引起单个细胞合成T的能力明显降低,从而影响T的合成和分泌。睾酮的合成和分泌受下丘脑-垂体-睾丸轴调节。而这一功能的实现不但有赖于下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)及脑垂体中黄体生成素(LH)的正常分泌，而且还需要Leydig细胞膜上黄体生成素受体(LHR)结构、数量及功能的完整，细胞核将所携带信息正常表达，以及线粒体、内质网等细胞器提供中间代谢等生化反应的场所和能量[14]。本实验结果显示，与NC组相比，DM组3β-HSD1 mRNA表达减低，同时血清中睾酮水平降低。似乎提示，糖尿病时睾丸Leydig细胞功能受损，可能不仅与持续高血糖引起的细胞代谢异常及氧化应激对垂体-睾丸轴造成损伤，血清LH水平降低，进而导致血清T水平下降有关，从而影响睾酮的合成有关。

【参考文献】

[1] Ballester J, Mu oz MC, Dominguez J,et al. Insulin-dependentdiabetes affects testicular function by FSH- and LH-linkedmechanisms[J].J Androl,2004,25(5):706-719.

[2] Miao J, Chan K W, Panesar NS. Blocking BRE expression inLeydig cells inhibits steroido- genesis by down-regulating 3-hydroxysteroid dehydrogenase[J]. Journal of Endocrinology,2005,185(3):507-517.

[3] Mindnich R, Haller F, Halbach F,et al.Androgen meta-bolismvia 17β-hydroxysteroid dehydroge-nase type 3 in mammalian and non-mammalian vertebrates:comparison of the hu-man and the zebrafish enzyme[J].Journal of MolecularEndocrino-logy,2005,35 (2):305-316.