视网膜挫伤兔模型的病理学观察

作者                作者单位

王志玉  中国福建省福安市，宁德市闽东医院眼科  

史爱云　中国福建省福安市，宁德市闽东医院眼科

Pathology observation of retinal contusion rabbit model

ZhiYu Wang, AiYun Shi

Department of Ophthalmology, Municipal Mindong Hospital of Ningde, Fuan 355000, Fujian Province, China

AbstractAIM: To set up the animal model of retinal contusion and to observe the retinal morphous characteristic. METHODS: Forty healthy rabbits without oculopathy were divided into 8 groups: 1 hour, 3 hours; 1 day, 3, 7, 14, 30 days after contusion and normal control, 5 rabbits in each group. Right eye of each rabbit was treated with Allens reformative hitting method as contusive retinopathy model. The eyeballs were enucleated at different times after contusive injury in rabbit retina. The pathological change of the retina was observed by light and electron microscope. The thickness changes of nerve fiber layer (NFL), inner nuclear layer (INL) were measured by ocaular micrometer. We counted the number of ganglion cell(GC) under light microscope. RESULTS: After contusion injury, the thickness of nerve fiber layer (NFL) obviously increased in 1 hour group, 3 hours group and 1 day group (P<0.05), but in 7 days group and 14 days group, the thickness of NFL obviously decreased (P<0.05). The NFL thickness of 3 days group, 30 days group and normal control group were similar (P>0.05). After contusion injury, the thickness of INL obviously increased in 1 hour group, 3 hours group and 1 day group (P<0.05), but in 7 days group and 14 days group the thickness of INL obviously decreased (P<0.05). The INL thickness of 3 days group, 30 days group and normal control group were similar (P>0.05). GC counted in every injury group was fewer than that in normal control group. Electron microscope revealed evidence of apoptotic cells after retinal contusion. They were detected in 3 hours group, 1 day group, peaked on 3 days group, and dropped precipitously in 7 days group. CONCLUSION: Retinal oedema and apoptosis is an important mechanism of sensory layer cell degeneration after retina contusion.

KEYWORDS: contusion of retina;animal model;pathology observation;retina

0　引言

视网膜挫伤是指眼部受到钝性外力击打所引起的视网膜损伤，其主要表现是急性视力损害和视网膜水肿、出血、变性、坏死，发病机制尚未完全明了。我们从建立动物模型入手，旨在于建立一种较为精确的兔眼挫伤性视网膜病变模型，以期了解挫伤性视网膜病变的病理变化，进一步探求视网膜挫伤的发病机制，为临床的治疗探寻新的思路。

1材料和方法

1.1　材料

Olympus普通显微镜;LKB2088型超薄切片机;JEM1200EX电子显微镜;健康成年无眼疾青紫蓝兔40只(福建医科大学动物中心提供)，体质量2～3 kg，雌雄兼用，外眼及眼底检查正常，选取右眼为致伤眼，随机数字表法分为挫伤后1，3h;1, 3, 7, 14, 30d组和正常对照组共8组，每组5只兔。改良Allen重击法，打击锤是一根质量为300g的铁棒，长300mm，直径12mm，表面光滑，外面是一根内径14mm带刻度的玻璃导向管，自0.98m高处以自由落体方式垂直击中兔眼角膜正中，致伤能量约为2.87J[1]。

1.2　方法

以戊巴比妥钠30mg/kg耳缘麻醉动物，麻醉完善后，将动物固定在动物台上，以保持右眼朝上，眼眶眶口平面与水平面平行，导向管与兔的眼眶紧密接触并保持垂直，兔眼位于导向管中央，打击锤从0.98m高度沿导向管垂直落向眼球，造成眼球挫伤，致伤后立即移去打击装置，将动物放入有新垫料的另一饲养箱内，室温25℃左右。所有造模由同一操作者序贯完成。伤眼直接对光反应迟钝，瞳孔散大，眼底观察视网膜乳白色混浊，水肿范围较大，同时伴有眼底出血，即认为模型制作成功，纳入实验。实验兔均在同一条件、不同时间点进行眼部伤情观察，检查眼球位置、结膜、角膜、前房、瞳孔、晶状体、玻璃体和视网膜。

1.2.1　光镜观察

在不同时间点分别经由耳缘静脉空气栓塞处死受试兔子后，摘除眼球，修剪眼球表面的多余组织，0～4℃生理盐水冲洗3次，后将眼球沿赤道部环状切开，剪除眼前节(角膜、虹膜、晶状体等)，吸除玻璃体，将眼后节浸入戊二醛中，常规脱水、浸蜡包埋，组织切片，HE染色。显微镜下观察每组病理切片视网膜的情况，目镜测微尺(0.01mm) 对视网膜神经纤维层 (nerve fiber layer，NFL) 厚度及内核层(inner nucler layer，INL) 厚度进行测量，并对视网膜神经节细胞(ganglion cell，GC) 计数。每组取两张病理切片进行分析，每张切片于鼻、颞侧距视盘1.33mm处对称部位各取一个视野进行观测，共4个观察点，4个测量值相加取平均值作为每眼的最终观察值。

1.2.2　电镜观察

摘取兔眼球后，在垫有冰液的平皿上，沿赤道部剖开眼球，迅速去除角膜、晶状体及玻璃体，置体积分数2.5g/L的戊二醛磷酸缓冲液中4℃下固定3～4h，将眼杯后极部视盘颞侧组织切成1mm×3mm的条块，放入pH7.2的磷酸缓冲液中4℃以下浸洗后，锇酸固定40min，巴比妥缓冲液浸洗，梯度乙醇、丙酮脱水，无水乙醇与环氧树脂浸透、包埋，半薄切片定位。定位后将标本修成块状，超薄切片机将标本切成40～60μm厚的薄片，铜网捞片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，电子显微镜观察并拍照。电子显微镜由专业技术人员操作。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件进行数据统计学处理。GC计数、NFL及INL厚度以±s表示，n代表每组的眼数;首先进行方差齐性检验，符合正态分布采用方差分析中均数的两两比较进行分析，P<0.05为差别有统计学意义。

2　结果

2.1　病理组织学改变

正常组：内界膜(inner limiting membrane，ILM) 和神经纤维层(NFL)平滑完整，NFL水平排列，较规整，厚度约23.9±0.4μm;神经节细胞层 (ganglion cell layer，GCL) 呈单层排列，细胞核较大且稀疏少见，呈圆形或椭圆形，染色较淡，排列整齐;内丛状层 (inner plexiform layer，IPL) 较厚，呈较明显的网状结构，较疏松;内核层 (inner nucler layer，INL)胞核较大，染色稍深，排列整齐，厚度约24.9±0.4um;外丛状层(outer plexiform layer，OPL) 明显薄于IPL，且网状结构也不如IPL明显;ONL可见7～8层细胞，视锥视杆细胞的胞核密集分布，排列整齐，染色均匀，呈深蓝色，胞质较少;GC记数15.40±1.17个;视锥视杆细胞层呈规则的毛刷状，内、外节整齐有序，染色均匀。伤后1 h组：主要表现为视网膜各层组织的高度水肿，GC及INL细胞排列紊乱，其中以NFL与IPL水肿最明显，染色较淡。NFL增厚(约25.0±0.3μm)，与对照组(23.9±0.4μm)及伤后3d(24.2±0.5μm)，7d(22.3±0.7μm)，14d(23.0±0.8μm)，30d组(23.8±0. 3μm)相比有显著差异(P<0.05);INL也增厚(约26.7±0.6μm)，与对照组及伤后其它各组相比有显著差异(P<0.01)，(对照组24.9±0.5μm;3h组28.1±0.5μm;1 d组27.8±0.5μm;3d组25.1±0.5μm;7d组23.7±0.6μm;14d组23.2±0.3μm;30d组24.8±0.8μm);GC计数减少(约9.90±1.29个)，与对照组(15.40±1.17个)及伤后3h组(8.00±1.33个)，1d组(7.70±1.77个)，14d组(11.80±1.55个)，30d组(11.60±1.58个)相比有显著差异(P<0.05);视杆视锥细胞层高度水肿，内外节排列紊乱。伤后3 h组：视网膜水肿已经开始减轻，NFL和INL仍水肿增厚，GC数目减少。除1h组及1d组外，NFL厚度(24.8±0.4μm)与对照组及伤后其它各组厚度相比有显著差异(P<0.01);除1d组外，INL厚度与对照组及伤后其它各组厚度相比有显著差异(P<0.01);除1, 3d组外，GC计数与对照组及伤后其它各组GC计数相比有显著差异(P<0.01)，ILM不完整，GCL有断裂，IPL，INL及ONL排列紊乱，视杆视锥细胞层内外节失去正常排列顺序。伤后1d组：视网膜轻度水肿，主要表现是GC数目减少，细胞变性。除1, 3h组外，NFL厚度(24.8±0.5μm)与对照组及伤后其它各组厚度相比有显著差异(P<0.05);除3h组外，在INL厚度及GC计数上，与对照组及伤后其它各组相比有显著差异(P<0.05)，细胞排列紊乱;ONL变化不明显，可以见到NFL及INL有中性粒细胞浸润，视杆视锥细胞层水肿减轻。伤后3d组：视网膜水肿基本消退，内层变薄，可以见到视网膜较长片段的GC缺失。除对照组及30d组外，NFL及INL厚度与伤后其它各组厚度相比有显著差异(P<0.01);除1, 3h组外, GC计数(9.20±1.81个)与对照组及伤后其它各组相比有显著差异(P<0.05)，视杆视锥细胞层水肿基本消退，内外节排列仍紊乱。伤后7d组：NFL及INL较薄，INL细胞排列较紊乱，ONL的变化不明显，NFL厚度与对照组及伤后其它各组厚度相比有显著差异(P<0.01);除14d组外，INL厚度与对照组及伤后其它各组相比也有显著差异(P<0.01);GC计数减少(约11.30±1.95个)，除1h组，14d组和30d组外，GC计数与对照组及伤后其它各组相比也有显著差异(P<0.05)，视杆视锥细胞层水肿消退，内外节排列基本恢复。伤后14d组：NFL及INL变薄，GC计数减少，ONL变薄、胞核稀疏。NFL厚度与对照组及伤后其它各组相比厚度有显著差异(P<0.05);除7d组外，INL厚度与对照组及伤后其它各组厚度相比有显著差异(P<0.01);除14, 30d组外，GC 计数与对照组及伤后其它各组相比有显著差异(P<0.01)，视杆视锥细胞层内外节排列恢复。伤后30 d组：NFL厚度基本恢复，与对照组相比无显著性差异(P>0.05);与伤后其它各组相比有显著性差异(P<0.01)。INL轻度变薄，与对照组及伤后其它各组相比有显著差异(P<0.05);GC数目的减少，与对照组相比有显著差异(P<0.05);ONL层厚度未见明显异常，视杆视锥细胞层内外节排列正常。

2.2　透射电镜观察

正常组：兔眼ILM为一电子密度均匀、染色一致的结构;NFL微管及线粒体清晰可见;GC核较大，核仁、线粒体、内质网及核蛋白体清晰可见，线粒体呈圆形或长梭形，可见大量游离核糖体及微管;内核层中双极细胞呈圆形或椭圆形，胞质内可见线粒体等细胞器;外核层排列紧密，染色质分布均匀;外节盘膜密集呈板层状排列，整齐有序，与RPE顶端微绒毛镶嵌排列。伤后1h组：NFL线粒体肿胀，嵴变短甚至消失，微管减少或消失;GC计数减少，核浓缩，电子密度加深且不均匀，线粒体、内质网肿胀，线粒体嵴消失;INL细胞核浓缩，核膜电子密度加深且不均匀，感光细胞外节盘膜排列紊乱并有局限性断裂、脱离。伤后3h组：GC和INL细胞线粒体仍肿胀，嵴模糊不清，核染色质浓缩，体积缩小，密度增加，核膜厚薄不均。伤后1d组：GC和INL细胞核体积缩小，可见凋亡小体，表明存在凋亡现象。伤后3d组：GC和INL细胞核体积缩小，核碎裂，凋亡小体多见，外核层亦可见到凋亡小体的存在。伤后7d组：GC和INL细胞核体积基本正常，局部仍可见胞核浓缩、核膜电子密度不均匀。伤后14d组和30d组：GC和INL，ONL结构正常，核仁清晰可见、胞质细胞器丰富，线粒体结构清楚，染色质分布均匀。

3　讨论

损伤程度一致的动物模型的建立，是进行视网膜挫伤相关基础研究面临的一个重要课题。当前，国内外学者所建立视网膜挫伤动物模型各具特点[24 ]，为后继研究奠定了坚实基础。但目前已有的损伤方法，有的不太接近于临床实际受伤状态，或者缺乏较为精确的损伤定量，难以建立均一的损伤模型以便于对照观察。因此，研制和建立一个较为理想的视网膜挫伤动物模型对于后续研究大为裨益。我们研制出以带刻度的玻璃管作为导向管，便于观察;铁棒表面光滑及玻璃导向管，都可以减小摩擦，使打击能量较为精确;铁棒两端钝圆以避免打击时眼前段的损伤;打击前消毒玻璃导向管及铁棒，操作后兔眼结膜囊内涂红霉素眼膏以防止感染;以自由落体方式垂直击打兔眼角膜正中，整个操作步骤简单，对于操作者依赖性小，较为客观。对实验动物模型评价的主要标准就在于能否复制出与人相似的病理模型。目前认为理想的视网膜挫伤动物模型应当是：(1)设备简单，操作简便;(2)损伤程度可精确定量，保证造成大量、均一的视神经挫伤动物模型;(3)动物死亡率低;(4)致伤状态最大限度接近于临床受伤状态，以保证实验研究的临床意义。我们设计研制的视网膜挫伤动物模型，可基本达到上述要求，在一定程度上为视网膜挫伤的实验研究奠定了的基础。Sipperley等[5]猴视网膜挫伤模型的组织病理学检查中发现光感受器外节断裂，24h内RPE细胞开始吞噬感受器的外节碎片，48 h内RPE细胞迁移入碎片中，并逐渐移入视网膜内层直到GCL和IPL。在玻璃膜上，光感受器完全消失的严重受损区，RPE细胞增生直到最终与感受器的外节直接对接，OPL和ONL最后变薄。窦宏亮等[6]对实验模型的眼血液动力学研究发现挫伤后出现脉络膜血液循环功能的紊乱表现为血管的痉挛收缩然后扩张充血等变化。安美霞等[7]造成的兔眼视网膜挫伤模型的电镜和TUNEL染色均显示挫伤后3d视网膜外核层出现较多的具有凋亡形态学与生化改变特征的凋亡的感光细胞。故有学者推论挫伤后眼血液动力学变化引起的血流量降低、缺血再灌注损伤、视网膜浅脱离使感光细胞失去了色素上皮细胞的支持作用，以及挫伤本身的机械性损伤都可能是挫伤性感光细胞凋亡的原因[810]。我们以2.87J的能量、自由落体方式打击兔眼球造成了兔眼视网膜的损伤，光镜下显示：伤后1, 3h及1d主要表现为视网膜各层组织的高度水肿，其中以神经纤维层与内丛状层的水肿最明显，明显增厚，染色较淡，GC空泡变性。我们研究发现视网膜挫伤后，其组织变化遵循一定的规律：伤后1d 至伤后30d GC数目减少，视网膜挫伤早期GC数目减少是由于视网膜水肿、单位空间增大所致，而后期(7，14，30d)GC数目减少是细胞凋亡的结果;NFL及INL厚度的变化是一个由厚变薄再增厚的过程，早期(1，3h; 1d)增厚是由于视网膜水肿所致，而后期(7，14d)由于细胞凋亡而变薄，30d后厚度基本恢复。电镜显示挫伤后3h;1，3d组在视网膜各细胞层均出现较多的、具有凋亡形态学的细胞，其中在3d组视网膜各细胞层凋亡细胞数量达到高峰，与以往研究结果一致[1114]，表明感光细胞的凋亡是挫伤性视网膜病变的一个重要机制。

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