常染色体显性遗传非综合征性耳聋DFNA9的分子病理学机制

作者                  作者单位

孙勍    解放军总医院耳鼻咽喉科研究所 (北京　100853)

袁慧军  解放军总医院耳鼻咽喉科研究所 (北京　100853)

韩东一  解放军总医院耳鼻咽喉科研究所 (北京　100853)

遗传性聋分为非综合征性耳聋(non-syndromic hearing impairment，NSHI)和综合征性耳聋(syndromic hearing impairment，SHI)。全部NSHI和绝大部分SHI是孟德尔遗传单基因病，极少部分SHI是染色体病。学语前聋70%是NSHI，30% 是SHI，学语后聋基本上是常染色体显性遗传NSHI[4]。综合征性耳聋是全身多处病变伴听力障碍的综合症候群。非综合征性耳聋以听力损失为单一症状，大约80% 的非综合征性耳聋表现为常染色体隐性(DFNB)遗传方式，15% 表现为常染色体显性(DFNA)遗传方式，X连锁遗传(DFN)占 2% ～ 3%，其余不足 1% 为线粒体遗传[4]。

NSHI被证明是具有遗传异质性的一种疾病。遗传性听力下降网站主页所公布的遗传位点(locus)中，常染色体显性遗传形式54个，常染色体隐性遗传形式59个， X连锁遗传形式8个[5]。迄今，DFNA和DFNB各有21个基因被克隆，其中包括6个基因既可以表现为DFNA，也可以表现为DFNB遗传方式(如GJB2、GJB6、TECTA、MYO7A、MYO6、TMC1);1个X连锁遗传耳聋基因被克隆; 2个线粒体基因与非综合征性听力下降相关。这些不同遗传形式的耳聋可以具有相同或相似的表型，仅仅依靠这些患者的表型特征和听力学特点常常不能加以区别[6]。DFNA9位于常染色体14q12 - 13之间9厘摩(cM)的区域内 ，表现为迟发的、进行性高频听力下降，甚至全聋，是目前发现的唯一伴有前庭功能障碍的常染色体显性遗传非综合征性耳聋[7]。COCH基因在染色体上的定位与DFNA9的定位区域有重叠，是人类DFNA9的候选基因[8]。

1　COCH基因

1.1　COCH的发现及保守性分析

COCH(coagulation factor C homology)是人类发现的第一个伴有前庭功能障碍的DFNA基因[7]。COCH的发现得益于人类耳蜗cDNA 文库的建立。1994年Robertson等人利用减数杂交和分级筛查法建立人类胎儿耳蜗cDNA文库时, 发现了新的耳蜗基因——Coch-5B2 的部分序列, 后改名为COCH 基因。

1994年Robertson等人报告了小鼠COCH基因的氨基酸序列及染色体定位。人类与小鼠的COCH氨基酸序列具有高度保守性。比较人类与小鼠的COCH核苷酸序列，它们的开放阅读框(open reading frame，ORF)89%的核苷酸序列是相同的。同源区域在翻译终止密码子后突然中断，提示3’端的非翻译区缺乏保守性。人类COCH的ORF包含550个氨基酸，小鼠包含552个氨基酸。人类与小鼠COCH氨基酸数目之间的区别表现在：人类以4个重复的亮氨酸结尾，小鼠以6个重复的亮氨酸结尾[6]。1998年Robertson等发现COCH在人类、小鼠和鸡中具有高度保守性，人类COCH氨基酸序列94%与小鼠、79%与鸡同源[8]。

1.2　COCH在染色体上的定位及其结构

1997年Robertson通过Southern印记杂交法将COCH定位于人类14号染色体长臂q11.2–13(chromosome 14 in band q11.2 - q13)[6]。小鼠的COCH定位于12号染色体，与人类14q11.2 - q13同源区域。COCH包含12个外显子，起始密码子ATG位于第2外显子，开放阅读框于12外显子结束。COCH编码cochlin蛋白，cochlin包括N-末端终止信号肽(N-terminal signal peptide，N-SP)，LCCL结构域 (Limulus factor C Cochlin, and late gestation lung protein)，以及2个与非胶原结构糖蛋白A型(von Willebrand factor type A，vWFA)结构域同源的区域。LCCL结构域与古代无脊椎动物鲎凝固因子C、妊娠晚期肺蛋白Lgl1及眼玻璃质酸蛋白同源，含有100个氨基酸。vWFA结构域包含200个氨基酸，与胶原纤维蛋白、糖蛋白、蛋白聚糖相结合，参与凝血、补体系统、免疫系统和细胞外基质等功能。LCCL结构域由第4和第5外显子编码，外显子8 ~ 10编码vWFA1结构域，第11和12号外显子编码vWFA2结构域[8, 9]。

已知蛋白中较少存在LCCL结构域，多重比对及LCCL结构域二级结构的预测显示其存在6个β-螺旋和2个α-单环，2个二硫键使其连接更为紧密。这一区域富含半胱氨酸，在小鼠、牛、鸡、斑马鱼等动物蛋白结构中具有保守性，其功能尚不清楚，但是包含与脂多糖相结合的区域，推测LCCL结构域具有决定蛋白质结构或者宿主防御作用的功能。LCCL区域具有特殊的功能，与DFNA9的病理学密切相关。LCCL区域的氨基酸突变干扰二硫键的形成，破坏蛋白质正常折叠和蛋白质结构，扰乱这一区域的功能，并影响其下游的vWFA区域，导致vWFA区域与其他分子相结合，引起嗜酸性粘多糖沉积，临床表现为听力下降和平衡功能障碍。vWFA区域位于COCH的侧翼，缺少半胱氨酸残基，COCH LCCL区域与vWFA区域没有重叠。cochlin包含其它分泌蛋白所共有的结构域，其结构特点显示它是一种分泌蛋白：①缺少跨膜区;②存在2个vWFA结构域，细胞与细胞外基质的相互作用、细胞粘附、细胞膜受体、可溶性均与这一区域有关;③存在信号肽。

1.3　COCH及其编码的cochlin蛋白在耳蜗中的表达

Robertson等应用Northern印记杂交法发现COCH mRNA仅在人类耳蜗和前庭组织中高表达，在人类大脑、小脑、眼、脊髓、脾脏、淋巴结、肺、骨骼肌组织中均为低表达;COCH在小鼠耳蜗、前庭、脾脏高表达，在小脑、脊髓、胸腺中等表达，在肺和眼组织低表达。COCH在人类与小鼠中有不同的表达，说明COCH突变在两种物种中具有不同的表型[6， 8]。应用原位杂交和免疫组化法观察COCH mRNA在人类及小鼠耳蜗、前庭器官中的表达，耳蜗中COCH mRNA在螺旋缘和螺旋韧带细胞高表达;成年小鼠颞骨切片中COCH mRNA的表达与人类一致。在前庭器官COCH mRNA高表达见于半规管壶腹嵴感觉上皮下的间质细胞。耳蜗和前庭器官在发育、解剖结构及功能上具有相似性，因此可以表现为二者同时出现功能障碍。

COCH编码的cochlin蛋白在构成耳蜗细胞外基质和调节神经传导中起重要作用，它的缺陷与听力损失有关。Ikezono发现cochlin是内耳细胞外基质非胶原成分的重要组成部分。人类存在2种cochlin亚型：~ 63 kDa和 ~ 40 kDa，牛存在3种亚型：~ 63 kDa、~ 44k Da、和 ~ 40kDa，cochlin具有明显的分子异质性。cochlin亚型的异质性是由于选择性mRNA剪切，外显子跳跃，或者翻译后蛋白酶水解加工造成的[10]。2001年Robertson等应用COCH编码蛋白cochlin的抗体，研究COCH在耳蜗和前庭器官的分布及其在维持正常听觉功能中所起的作用，分析临床DFNA9的病理机制。Robertson发现cochlin蛋白在耳蜗螺旋韧带和螺旋缘纤维细胞、前庭器壶腹嵴感觉上皮下的间质中高度表达[11]。2003年Robertson通过将COCH蛋白质编码区转染至哺乳动物细胞系，对cochlin进行研究。结果表明cochlin是一种分泌蛋白，经由内质网或线粒体分泌，通过蛋白 水解和糖基化过程变成成熟的cochlin蛋白。cochlin的水解 发生于LCCL区域与vWFA区域之间，而糖基化发生于N 末端[12]。

2　DFNA9

常染色体显性遗传NSHI 临床上大多表现为学语后进行性感音神经性聋，语言发育正常。DFNA9是目前发现的唯一伴有前庭功能障碍的常染色体显性遗传非综合征性耳聋。

2.1　DFNA9的临床特点

DFNA9患者的听力损失发生于10岁至40岁，最初表现为高频听力下降。听力损失进行性加重，部分患者在60岁时发展为全聋。除听力受损外，DFNA9患者还表现为前庭功能障碍。前庭功能障碍有不同程度的外显率，一些患者通过视觉和本体感觉的补偿机制可以减轻平衡障碍的症状，仅在详尽的前庭功能检查时有异常表现;而有些患者表现为眩晕反复发作等严重的平衡障碍[13]。迄今，已经报道DFNA9家系COCH的9种突变(表1)。某些COCH基因突变前庭功能障碍完全外显(比利时-荷兰家系P51S突变、澳大利亚家系I109N突变、匈牙利患者V104del突变、日本患者A119T突变、荷兰家系G87W突变);而在美国家系的突变(V66G、G88E、W117R)和德国家系C542F突变，并不是所有的携带者都存在前庭功能障碍的表型。

2.2　DFNA9的组织病理学

DFNA9患者的颞骨病理切片发现其特有的组织病理学改变：耳蜗和前庭的神经通路有嗜酸性物质沉积，导致神经元树突变性，耳蜗和前庭感觉器官被破坏。以前应用光学显微镜发现颞骨切片沉积物中包含粘多糖，近来应用电子显微镜观察发现沉积物包含致密、多分枝、排列紊乱的微纤维结构，其中含有颗粒状物质可能是氨基葡聚糖[11]。颞骨病理切片中螺旋缘、螺旋韧带高度表达cochlin的细胞数目减少，表明嗜酸性物质积聚引起细胞死亡。这些区域缺少正常的II型胶原纤维，存在明显的变性。

2.3　DFNA9动物模型

2005年Makishima等用敲除LCCL结构域的小鼠研究COCH基因功能，发现敲除LCCL结构域的纯合小鼠内耳没有cochlin蛋白表达，杂合小鼠COCH mRNA表达于耳蜗和前庭的非感觉上皮和间质区域。但是通过短声和短纯音诱发的听性脑干反应(auditory brainstem response，ABR)敲基因纯合小鼠与杂合小鼠、野生型小鼠没有区别。因而推测DFNA9不是因为COCH突变、COCH单倍剂量不足导致，而是与内耳非感觉上皮区域负显性或者增益放大作用有关[14]。

3　DFNA9的分子病理学机制

3.1　导致DFNA9的COCH突变

COCH在染色体上的位点与DFNA9的区域有重叠。COCH作为人类DFNA9的候选基因，其突变引起进行性听力下降和前庭功能障碍，学者们进行了相关报告(表1)。1998年Robertson报道了三个来自美国的DFNA9家系COCH基因突变病例：第一个家系是位于第4外显子253核苷酸发生了T-G转换， 导致编码氨基酸缬氨酸(Val)-甘氨酸(Gly)替换V66G;第二个家系是位于第5外显子319核苷酸发生了G-A转换，导致编码氨基酸Gly-谷氨酸(Glu)替换G88E，第三个家系是位于第五外显子405核苷酸发生了T-C转换，导致编码氨基酸色氨酸(Trp)-精氨酸(Arg)替换W117R[8]。1999年De Kok报道在四个荷兰家系中发现COCH基因突变，四个家系的COCH突变均为第4外显子208核苷酸C-T转换, 导致编码氨基酸脯氨酸(Pro)-丝氨酸(Ser)替换P51S[15]。 1999年Fransen报道了一个比利时大家系和两个荷兰小家系COCH基因突变, 突变发生于第4外显子151核苷酸C-T转换, 导致编码氨基酸Pro-Ser替换P51S[16]。2001年Kamarinos等在一个澳大利亚家系发现COCH 基因突变：第4外显子253核苷酸T-A颠换, 导致编码氨基酸异亮氨酸(Iso)-天冬氨酸(Asp)替换I109N[17]。2001年Fransen对比利时和荷兰南部多个表现为DFNA9症状的家系和散发病例进行了COCH筛查，发现了部分家系和散发病例第4外显子151核苷酸C-T转换, 导致编码氨基酸Pro-Ser替换P51S[18]。2003年Usami对日本一表现为听力和前庭功能障碍, 且家族史阳性的患者进行COCH 基因筛查，发现第5外显子355核苷酸A-G转换, 导致编码氨基酸丙氨酸(Ala)-苏氨酸(Thr)替换A119T[19]。2004年Nagy等在17名进行电子耳蜗植入的DFNA9患者中进行COCH基因筛查，发现1名匈牙利患者COCH基因第5外显子367 ～ 369核苷酸缺失，导致编码氨基酸Val缺失Val104[20]。2005年Street等对一个欧洲DFNA家系进行连锁分析和位置候选基因筛查，发现12外显子第1625核苷酸G-T突变，导致编码氨基酸半胱氨酸(Cys)-苯丙氨酸(Phe)替换C542F[21]。2006年Collin等在一个迟发性、进行性听力损害的荷兰DFNA家系中发现第5外显子259核苷酸G-T突变，导致编码氨基酸色氨酸-甘氨酸替换 G87W[22]。目前已知的COCH突变在人类、小鼠和鸡中具有高度保守性。

3.2　DFNA9组织病理学与COCH在耳蜗中表达的关系

学者们观察COCH在人类耳蜗和前庭器官中的表达，与临床表现为耳聋和前庭功能障碍、分子病理学检测发现COCH突变的DFNA9患者的颞骨组织病理进行比较。DFNA9患者耳蜗螺旋韧带、螺旋缘、球囊和壶腹嵴有大量嗜酸性物质沉积，这些区域与COCH mRNA及其编码蛋白cochlin在耳蜗和前庭器官中的表达相一致。DFNA9的组织病理学研究发现，耳蜗和前庭器官螺旋神经节和壶腹嵴大量细胞缺失，这些区域同样是COCH在人类胚胎中高度表达的区域[24, 25]。cochlin的表达与DFNA9患者嗜酸性物质沉积之间的空间关系表明在这些区域存在蛋白质变性，或者是改变了cochlin与其它蛋白质(例如胶原纤维蛋白)的结合。耳蜗cochlin的表达区域包含许多离子通道，它们通过螺旋缘及螺旋韧带中的K+ 循环，在维持内环境的稳态中起重要作用。COCH突变导致螺旋缘及螺旋韧带嗜酸性物质沉积，干扰了通道处的离子内流，影响了正常耳蜗功能。学者们推测DFNA9迟发性、进行性听力下降是由于COCH错意突变，影响cochlin的结构和功能，或者干扰cochlin与内耳其它细胞外成分的相互作用，最终导致嗜酸性物质沉积和细胞死亡，引起听神经和前庭神经变性，破坏耳蜗和前庭器官正常支持结构和离子平衡，继而出现听力下降和前庭功能障碍[26]。

3.3　DFNA9的病理机制

到目前为止，学者们发现大多数导致DFNA9的cochlin蛋白突变发生于LCCL结构域。单碱基杂和突变导致氨基酸残基改变或者氨基酸缺失，并且在人类、牛、小鼠、鸡中具有保守性(除外V66G突变在鸡中不具有保守性)。细菌表达野生型和突变型cochlin LCCL结构域片断，大多数突变干扰其正常结构，导致结构域的错误折叠。cohclin蛋白富含半胱氨酸的结构域突变将改变其整体结构和可溶性，干扰这一结构域或者其下游2个vWFA结构域的功能。仅在一个德国DFNA9家系发现位于vWFA2结构域的单碱基杂和突变导致氨基酸残基改变，保守性分析显示在人类、小鼠、鸡、斑马鱼中高度保守。学者们推测，位于vWFA2结构域的突变，第2个vWFA结构域的折叠及COCH在细胞内的转运可能会受到影响。

DFNA9患者已知的位于LCCL结构域的COCH突变，P51S、V66G、G88E、I109N、G87W突变导致LCCL结构域的错误折叠，W117R、A119T突变不影响LCCL结构域的正常结构。后2种突变在空间位置上非常接近，因此推测这2种突变引起的病理机制是一致的。值得注意的是W117R突变与V66G突变、G88E突变引起的组织病理学改变一致，说明可能存在不同的分子机制引起DFNA9的病理改变。学者们发现细胞外基质中没有突变的cochlin，它们通过vWFA结构域与细胞外基质中的胶原纤维或者其它成分相结合。LCCL结构域具有多种功能，首先，LCCL结构域调节cochlin在细胞外基质中的沉积，V66G、G88E、I109 N突变抑制了这一过程。其次，LCCL结构域调节cochlin与细胞外基质的相互作用，W117R、P51S突变阻碍了它的作 用[19]。虽然突变型cochlin的合成、糖基化和分泌过程与野生型一致，但是突变型cochlin表达于细菌和哺乳动物细胞株时出现LCCL结构域的错误折叠。这些研究结果显示DFNA9突变通过负反馈或者功能放大作用影响耳蜗功能。

4　COCH与梅尼埃病

COCH突变家系表现为成年发病的渐进性感音神经性耳聋，并且大多数携带者伴有前庭功能障碍。颞骨病理观察发现听神经末梢变性及上皮下嗜酸性物质积聚，甚至出现内淋巴积水(endolymphatic hydrops, ELH)[23， 24]。COCH是在耳蜗和前庭均有表达的基因，症状上的相似及ELH的出现引发了COCH异常与梅尼埃病(Meniere disease，MD)的关系的探讨，因此其是否为MD的致病基因受到很多学者的关注。

国外学者研究发现，COCH突变所致DFNA9与MD有着很多相似之处：首先，DFNA9为常染色体显性遗传性疾病，而MD患者可有家族遗传病史，家族性MD患者则具有常染色体显性遗传特征[27];其次，二者均为后天获得性进行性听力下降，同时伴有前庭功能障碍症状。但是DFNA9和MD也有着明显的不同：DFNA9几乎全部为家族性发病，听力障碍多先波及高频，前庭症状多为平衡不稳;而临床所见MD则以散发病例为主，听力障碍多先波及低频，前庭症状多为眩晕。两者的病理特征也有着本质的差异：光镜检查发现DFNA9患者耳蜗和前庭器官嗜酸性粘多糖沉积，电镜检查则在耳蜗、前庭发现大量结构紊乱的微纤维样结构[28];而MD的基本病理特征为内淋巴积水。关于COCH突变与MD发生的关系有两种不同的观点。Robertson等认为，突变COCH编码的异型蛋白引起耳蜗/前庭间质组织内出现嗜酸性物质(为异型蛋白本身或其诱发其它细胞外基质成分降解的产物)，间质内感觉神经末梢变性，继之神经细胞萎缩、消失，导致DFNA9患者的渐进性耳聋及前庭功能障碍[6, 11]。但是Fransen 等[16]和 Verstreken等[29]学者报告DFNA9患者除听力损失和前庭功能障碍外，25%的患者出现发作性眩晕，伴有耳鸣、耳闷胀感、恶心、呕吐症状，这些症状与梅尼埃病很相似。以Robertson的理论推测无法解释发作性耳蜗/前庭症状。因此，Fransen等提出COCH功能与内淋巴平衡有关，基因突变可能破坏了细胞外基质结构，波及耳蜗螺旋韧带成纤维细胞间的缝隙连接，干扰了内耳正常钾离子循环通路，破坏了内、外淋巴液水电解质平衡，导致波动性听力下降及发作性眩晕，据此认为COCH的异常与MD发生密切相关。李洪涛等通过原位杂交发现，内淋巴囊周围间质细胞也表达COCH，其mRNA的水平与耳蜗螺旋韧带相似，强于壶腹嵴感觉上皮下的间质细胞[30]。

Morrison等[27]对家族性和散发MD患者进行COCH全序列分析，均未发现COCH突变，他们认为COCH可能不是MD的主要致病原因。2003年Usami[19]对20例散发的梅尼埃病患者进行了COCH全序列分析，未发现COCH突变, 作者认为COCH基因突变可能不是梅尼埃病, 尤其不是散发梅尼埃病的主要致病原因。孙燕等收集47例临床诊断为MD的患者(2例MD患者家族史阳性)，对其进行COCH基因第4、5外显子序列分析，探讨COCH 4、5外显子突变与MD的相关性。 结果47例MD患者COCH 4、5外显子均未发现突变[31]。

耳蜗螺旋韧带成纤维细胞具有活跃的离子转运功能，与内淋巴水、电解质平衡关系密切[32]，COCH基因在耳蜗螺旋韧带高表达，对其与内淋巴分泌吸收关系的探讨有一定提示意义。此外，内淋巴囊是内耳免疫应答的中心部 位[8]，目前发现的人类COCH基因突变大多数集中于LCCL结构域，此区域与鲎凝血因子C、Lgl1局部序列同源。鲎凝血因子C、Lgl1蛋白均参与非体液免疫应答反应[33]。是否提示COCH与内耳免疫反应有关，有待进一步研究。

5　展　望

COCH是人类发现的第一个伴有前庭功能障碍的常染色体显性遗传非综合征性耳聋基因。COCH突变可以导致患者出现一系列耳蜗、前庭功能障碍症状，也有些患者出现典型的梅尼埃病症状。目前COCH基因及其编码的cochlin蛋白的功能尚不完全清楚，COCH基因是否为梅尼埃病的致病基因尚存争议，DFNA9的病理机制并不完全清楚。

总之，COCH基因突变在DFNA耳聋群体中发病率高，可以作为迟发性语后聋一线检测基因。通过对更多中国DFNA家系和迟发性语后聋病例进行COCH全基因突变筛查，可以了解DFNA耳聋群体COCH基因突变发生率及突变谱，找到更多的COCH致病性基因突变并揭示其分子病理机制。COCH可能在梅尼埃病等感音神经性聋的致病过程中起着重要的作用，随着人们对COCH基因以及其编码的cochlin 蛋白功能的深入研究，COCH基因与梅尼埃病等感音神经性聋疾病的相互关系将得到进一步阐明。

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