兔肝硬化肝癌与单纯肝癌立体定向照射后病理形态学对比分析

作者             作者单位

丁轶   广州南方医科大学南方医院510515

陈斌   广州南方医科大学南方医院510515

陈龙华 广州南方医科大学南方医院510515

原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，预后差。我国每年死于原发性肝癌者超过11 万人，占世界原发性肝癌死亡人数的45%[1]。目前早期肝癌治疗仍首选外科手术。随着放射物理的发展，适形放疗技术的实施，肿瘤靶区在受到确切的适形的高剂量照射的同时保护了周围正常肝组织[2]，放射治疗已逐渐成为非手术治疗肝癌的主要方法之一[3,4]。本研究拟在兔肝硬化肝癌基础上行单次不同剂量立体定向照射，应用组织病理学、组织化学观察肝病状态下肝癌照射后的病理形态学变化，以期指导肝癌三维适形放疗，提高临床治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 兔肝硬化肝癌与单纯肝癌模型的制备 25只雄性新西兰大白兔，采用四氯化碳(CCl4，1.598g/ml)胃内给药方法，1次/周，起始剂量为50mg/kg，加入2ml玉米油中混合成5%的油溶液，并根据实验组1耐受情况逐渐加量，最大剂量可加量至CCl4160mg/kg，加入3ml玉米油中合成10%油溶液。给药共6个月，制成兔肝硬化模型。将16只成功制成肝硬化的实验兔(实验组1)，按外科手术方法将VX2肿瘤细胞原位接种在兔肝右叶上，制成兔肝硬化肝癌模型。8只正常雄性新西兰大白兔(实验组2)，按上述手术方法同样接种VX2肿瘤细胞，制成兔单纯肝癌模型。

1.1.2 动物及分组处理 已成功制备的肝硬化肝癌兔16只(实验组1)和单纯肝癌兔8只(实验组2)，被随机分成A和B两组，每组各12只(实验组1为8只，实验组2为4只)，分别给予20Gy和30Gy立体定向照射，照射后第3周处死取肝组织，常规制备石蜡切片备用。所有实验动物均为新西兰雄性大白兔，平均体重3～3.5kg。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂 网状纤维染色相关试剂：(1)0.25%高锰酸钾液;(2)2%草酸液;(3)2%硫酸铁铵水溶液;(4)Gomori氏银氨液;(5)10%中性甲醛液;(6)核固红液。

Masson三色染色相关试剂：(1)Weigert氏铁苏木素;(2)立春红酸性品红液;(3)1%磷钼酸水溶液;(4)苯胺蓝液。

1.2.2 仪器 PICKER PQS 2000(AMERICA)全身螺旋CT;Medrad CT压力注射器;Leibinger STP3 (GERMANY) 立体定向适形放射治疗计划系统;Varian 600C/D直线加速器;石蜡切片机;电热恒温干燥箱;微波炉。

1.3 方法

1.3.1 实验组1与实验组2立体定向照射(stereotactic irradiation，SRT)计划实施 麻醉固定：兔用3%戊巴比妥钠以0.5ml/kg的剂量从耳缘静脉注射麻醉后固定在真空垫上;CT扫描定位：用PICKER螺旋CT从隔顶到肝右叶以3mm层厚定位扫描，先平扫，再用压力注射器以0.3ml/s注射碘必乐7ml(意大利MAKE公司)增强扫描，并将CT定位扫描信息传输至FISHER3DTPS(三维治疗计划系统)工作站中;靶区描画：按照国际辐射剂量单位与测量委员会的要求确定GTV(可测肿瘤区)、CTV(临床靶区)、PTV(计划靶区)、TV(治疗区)、IV(照射区);立体定向照射：按上述靶区分5～6个角度立体定向照射，分别给予实验组1及实验组2中A组单次剂量20Gy，B组单次剂量30Gy。用Varian600C/D直线加速器实施计划，采用6MV的X线照射，剂量率5Gy/min。

1.3.2 网状纤维染色(改良的Gomori氏法)[5] 切片平置于染色架上，滴入0.25%高锰酸钾液(要盖过切片)氧化5min;稍水洗;2%草酸液漂白1～2min;稍水洗;2%硫酸铁铵水溶液媒染5min;稍水洗;滴入Gomori氏银氨液作用3～5min;蒸馏水稍洗;10%中性甲醛液还原1min;流水冲洗5～10min;用核固红液复染5～10min;稍水洗;常规脱水透明，中性树胶封固;光镜下参照结果，胶原纤维呈棕黄色，网状纤维呈棕黑色。

Masson三色[6]：Weigert氏铁苏木素染5～10min，流水稍洗;1%盐酸酒精分化，流水冲洗数分钟;立春红酸性品红液染5～10min，蒸馏水稍冲洗;1%磷钼酸水溶液处理约5min;不用水洗，直接用苯胺蓝液复染5min;1%冰醋酸处理1min;95%酒精脱水多次;无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固;光镜下观察结果，胶原纤维呈蓝色，胞质、肌纤维红色。

2 结果

2.1 实验组1与实验组2照射前后病理形态学变化 见图1。

2.1.1 实验组1与实验组2照射前HE染色 将照射前因感染死亡的实验组2和实验组1兔解剖并行常规HE染色，实验组2正常肝组织中，肝小叶为多边形结构，肝细胞索在中央静脉四周呈放射状排列，肝细胞索间空隙为肝血窦。实验组1肝硬化组织中，正常肝结构被破坏，细胞排列紊乱，汇管区有较多纤维组织增生，分割肝小叶成假小叶结构。肝组织内接种的VX2细胞团，少数癌细胞凋亡及坏死，及少量结缔组织增生。

2.1.2 实验组1及实验组2 不同剂量照射后HE染色 实验组2癌组织周边正常肝组织接受照射单次剂量20Gy后，仅可见肝细胞水肿变性，见图1a;照射单次剂量30Gy后，可见肝细胞水肿变性，并可见灶性坏死，见图1d。

实验组1癌组织周边肝组织可见多灶性片状坏死，以靠近肿瘤组织周围的肝细胞坏死较明显，周围纤维组织断裂。肝硬化组织接受放疗20Gy照射后，可见肝组织内片状坏死，见图1b;而肝硬化组织放疗30Gy后，肝组织内呈大片状坏死，仅有少量肝硬化组织残存，见图1e。

肝VX2肿瘤SRT后3周：肿瘤区均可见大片坏死，癌细胞皱缩、细胞核碎裂、消失，周边可见残留少许癌组织，间质纤维组织肿胀，部分有断裂。给予肝癌放疗20Gy，癌组织内可见片状坏死，见图1c;给予肝癌放疗30Gy，可见癌组织内大片状坏死，有出血，见图1f。

实验组1及实验组2均未见肝静脉闭塞或血栓形成。

2.2 实验组1与实验组2照射前后病理组织化学网状纤维染色、Masson三色变化，见图2、3。照射前后行网状纤维染色及Masson三色染色，网状纤维染色将纤维组织染成黑色，Masson三色将纤维组织染成蓝色。

实验组2正常肝组织照射后纤维组织无明显改变，见图2a、2d，图3a、3d。

实验组1肝硬化组织照射前纤维组织明显增生，粗细不等，单次照射20Gy后可见部分胶原纤维断裂，见图2b，图3b;单次照射30Gy后则可见胶原纤维完全断裂，见图2e、3e。

肝VX2肿瘤照射前可见粗大的胶原纤维，单次照射20Gy后可见胶原纤维部分断裂，呈间断连接，见图2c，图3c;单次照射30Gy后,视野内胶原纤维完全断裂，未见连接，见图2f、3f。

3 讨论

网状纤维染色是常用的特殊染色之一[7]，网状纤维为细胞外间质成分，存在于人体各组织器官中，是Ⅲ型胶原纤维与嗜银蛋白多糖结合的产物，可由纤维母细胞、纤维细胞、血管外膜细胞等间叶细胞及间叶性肿瘤细胞产生，网状纤维染色将纤维组织染成黑色。Masson三色染色是结缔组织最常用的特殊染色方法[8]，主要用于区分胶原纤维和肌原纤维。

在本实验中，我们采用了网状纤维染色及Masson三色特殊染色观察肝硬化肝癌组织接受单次大剂量照射后纤维表达情况。网状纤维染色将胶原纤维呈棕黄色，网状纤维呈棕黑色[9]，Masson三色将胶原纤维染成蓝色，胞质、肌纤维红色[10]。照射前，在正常肝组织中，只有在汇管区可见少量纤维组织。而在肝硬化组织中，可见明显的假小叶结构，在肝癌组织中，纤维组织明显增生。给予照射后，正常肝脏背景下HE染色只见肝细胞出现变性，网染和Masson三色可见纤维组织未见明显改变，而肝硬化组织中给予20Gy照射HE染色后，可见肝组织内片状坏死，给予30Gy照射后，肝组织内呈大片状坏死，仅有少量肝硬化组织残存。在网染及Masson三色中可见20Gy剂量照射后部分胶原纤维断裂，30Gy剂量照射后则可见视野内胶原纤维完全断裂。肝病状态下给予两个剂量照射，纤维组织均出现不同程度的断裂，周围有少量纤维组织增生，说明在照射后肝硬化肝癌组织出现坏死，一定时间后表现为坏死后的增生，即临床上所说的放射性肝损伤的肝纤维化前期，一般表现在照射后4～12周，本实验由于观察期只有3周，所以肝纤维化表现的并不明显，并且也未表现出放射性肝损伤典型的肝静脉闭塞或血栓形成。

肝病状态下肝癌的放射治疗近两年已取得显著进展[11]，可延长中晚期肝癌患者的生存期和提高生活质量。随着放射技术及设备的不断改进[12]，放射生物学的不断发展，肝硬化肝癌的放射治疗将成为一种安全有效的手段之一。参考文献：

【参考文献】

[1] 叶维法，杨秉辉，万德森，等.肝胆肿瘤学[M].第1版.天津科学技术出版社，2000.35.

[2] Cheng JC，Wu JK，Huang CM，et al.Dosimetric analysis and comparison radiation therapy for patients with hepatocellular carcinoma and radiationinduced liver disease[J].Int Radiat Oncol Biol Phys，2003，56(1)：229234.

[3] Guo WJ，Yu EX.The longterm efficacy of combined chemoem bolization and local irradiation in the treatment of patients with large hepatocellular carcinoma[J].Hepatogatroenterology，2003，50(50)：500503.

[4] Seong J，Park HC，Han KH，et al.Clinicalresults and prognostic factors in radiotherapy for unresectable hepatocellular carcinoma：a retrospective study of 158 patients[J].Int Radiat Oncol Biol Phys，2003，55(2)：329336.

[5] 孙淑清，戴珂，方静宜，等.Gomori 网状纤维染色与免疫组织化学双重染色技术[J].中华病理学杂志，2000，29(5)：385.

[6] 胥维勇，杨群，范小莉.介绍一种改良Masson 三色染色法[J].诊断病理学杂志，2005，12(1)：63.

[7] Schwint OA，Labraga M，Cervino CO，et al.A modification of the staining technique of reticular fibres for image analysis of the cardiac collagen network[J].Cardiovasc Pathol，2004，13(4)：213220.

[8] Ding J，Yu J，Wang C，et al.Ginkgo biloba extract alleviates liver fibrosis induced by CCl in rats[J].Liver Int，2005，25(6)：12241232.

[9] Ramm GA，Carr SC，Bridle KR，et al.Morphology of liver repair following cholestatic liver injury：resolution of ductal hyperplasia，matrix deposition and regression of myofibroblasts[J].Liver，2000，20(5)：387396.

[10]Moon WS，Yu HC，Chung MJ，et al.Pale bodies in hepatocellular carcinoma[J].J Korean Med Sci，2000，15(5)：516520.

[11]Wunderink W，Romero AM，Osorio EM，et al.Target coverage in imageguided stereotactic body radiotherapy of liver tumors[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys，2007，68(1)：282290.

[12]Liang PC，Ch'ang HJ，Hsu C，et al.Dynamic MRI signals in the second week of radiotherapy relate to treatment outcomes of hepatocellular carcinoma：a preliminary result[J].Liver Int，2007，27(4)：516528.