兔眼滤过术联合应用苏拉明后滤过道的组织病理学观察

作者                          作者单位

熊林杰 华中科技大学同济医学院附属协和医院 眼科，湖北 武汉 430022

胡义珍 华中科技大学同济医学院附属协和医院 眼科，湖北 武汉 430022

曹阳   华中科技大学同济医学院附属协和医院 眼科，湖北 武汉 430022

徐志蓉 华中科技大学同济医学院附属协和医院 眼科，湖北 武汉 430022

邢星   华中科技大学同济医学院附属协和医院 眼科，湖北 武汉 430022

小梁切除术是青光眼滤过手术中的经典手术，但是手术后由于血—房水屏障的破坏及手术区的炎症反应、成纤维细胞的增殖，导致滤过泡瘢痕，使手术失败[1-2]。在临床上，术后辅助抗瘢痕形成的药物，如5-氟尿嘧啶、丝裂霉素(mitomycine，MMC)等，对改善滤过泡、降低眼内压、提高手术成功率起到一定的作用，但也有副作用及并发症，甚至有的药物有毒性作用[3-5]，使临床用药受到一定的限制，故需寻找一种吸收好、疗效高、毒副作用小的抑制青光眼滤过术后瘢痕形成的辅助药物。本实验选择20只健康成年家兔，对兔眼行小梁切除术，并对其巩膜瓣及结膜使用苏拉明，观察其降眼压效果，通过观察滤过泡组织病理学的变化，探讨苏拉明在青光眼滤过术后抑制瘢痕形成的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物和分组 健康成年白色家兔20只，雌雄不限，体重2.0～3.0 kg，平均为(2.42±0.36)kg，由同济医大动物中心提供。

1.2 药品和试剂 苏拉明(美国，sigma公司)，型号 50 mg/支，配成浓度500 μg/ml。天狼猩红染料、苦味酸(美国，sigma公司)。

1.3 实验动物分组 采用随机排列表法将实验兔分为两组，每组各10只兔(20只眼)。第1组：随机选择一只眼做小梁切除术(称trabeculectomy组，简称TR组)，另一只眼做小梁切除联合应用苏拉明(简称TR+S组);第2组：随机选择一只眼做小梁切除术联合应用MMC(简称TR+MMC组);另一只眼做小梁切除术联合应用苏拉明(简称TR+S组)。

1.4 手术方法 术前对所有家兔行常规外眼检查，均无外眼病。术前用0.5%地卡因表面麻醉后，用Tono-pen眼压计测量双眼术前眼压。用速眠新麻醉家兔，利福平眼水冲洗术眼，75%酒精消毒手术野，置孔巾，开睑，在颞上方沿角巩膜缘做以穹窿部为基地的结膜瓣和常规巩膜瓣，实验组在结膜瓣下使用药物浸润，对照组未使用任何药物。术后上四环素眼膏包扎。

1.4.1 TR组 均选择鼻上或者颞上象限做以结膜穹隆部为基地的结膜瓣，行标准的小梁切除术。

1.4.2 TR+S组 小梁切除术中完成结膜瓣和巩膜瓣后，用苏拉明500 μg/ml棉片在结膜和巩膜下放置5 min，不冲洗，再继续行小梁切除术，术毕结膜下注射0.3 ml的苏拉明。术后第1、第2、第3天均于结膜下注射0.1 ml的苏拉明，每日用聚光手电筒仔细观察结膜、角膜情况，前方有无出血、渗出，尤其注意滤过泡情况，并记录眼压。

1.4.3 TR+MMC组 小梁切除术中完成结膜瓣和巩膜瓣后，用MMC 0.2 mg/ml棉片在结膜和巩膜下放置3 min，用120 ml生理盐水冲洗，再继续行小梁切除术。

所有手术均由第一作者完成，手术后术眼均滴用氯霉素眼水。

1.5 实验方法

1.5.1 标本的制备 分别于术后第3、第7、第15、第30、第60天，由各组中随机选择2只兔，麻醉后自耳缘静脉注入30 ml空气处死;其余继续观察，至第2个观察时间再随机选择处死。取出眼球后，用生理盐水冲洗干净。剪取包括顺时针方向9~3点钟，角膜缘前后自1~2 mm透明角膜至距离角膜缘1 cm处的结膜，结膜下组织及巩膜发块状组织，放入10%的福尔马林液中固定，制作标本，再将标本行连续性切片制成病理切片。

1.5.2 组织病理学检查

1.5.2.1 Masson三色染色法 普通光学显微镜下观察Masson三色染色法结果，主要观察滤过道新生胶原纤维的增殖情况。病理切片中新生胶原纤维量依据高倍镜视野下结膜和巩膜间隙内新生胶原纤维的面积占切片中结膜和巩膜间的空间总面积计算[6]，共分为4级：0级<25%，+级26%～50%，++级51%～75%，+++级>75%。依据胶原纤维所占面积分级后，应用K-W检验法进行统计学分析，并进一步两两分析比较(Nemenyi法)结果。

1.5.2.2 普通光学显微镜下观察苦味酸—天狼猩红染色法结果[7] 天狼猩红(sirius red F3B)购于美国Sigma公司，配成1%的苦味酸—天狼猩红溶液，HMIAS-2000图像分析系统由同济医学院千屏影像公司提供。每只眼取1张切片，每张切片上随机取4个视野，摄100倍照片，摄像后照片电子文件输入计算机，获取面密度和吸光度(A)值(胶原染色测试指标)。两者均反映胶原含量、胶原化面积及程度。

1.5.2.3 普通光学显微镜下观察免疫组化染色方法(LSAB法)结果[6] 采用鼠抗人波形蛋白单克隆抗体的免疫组化染色法，主要观察滤过道成纤维细胞的增殖情况。依据病理切片中高倍镜视野下成纤维细胞的量分为4级：0级无成纤维细胞，+级1～5个，++级6～10个，+++级11～20个。采用第Ⅷ因子单克隆抗体的免疫组化染色法，主要观察滤过道新生血管情况，依据病理切片中高倍镜视野下新生血管量分为3级：0级无新生血管，+级1～5个，++级6～10个。应用K-W检验法进行统计学分析，并进一步两两分析比较(Nemenyi法)结果。

1.6 统计学方法 实验所得数据采用SPSS 13.0统计学软件进行统计学处理。采用秩转换的非参数检验(Kruskal-Wallis H 检验)进行统计学分析，独立样本的两两比较采用Nemenyi法检验。

2 结果

2.1 滤过道的新生胶原纤维量 病理切片采用Masson三色染色后，光镜下观察滤过道新生胶原纤维量。结果显示三种不同术式的滤过道均有不同程度的新生胶原纤维存在(见图1)。依据胶原纤维所占面积分级后，应用K-W检验法进行统计学分析，显示不同术式滤过道的新生胶原纤维量差异有统计学意义(x2=16.63，P<0.05)，见表1。结果表明不同术式对术后滤过道新生胶原纤维量均有影响。

进一步两两分析比较(Nemenyi法)结果：

①TR+S组滤过道新生胶原纤维量少于TR组，两组差异有统计学意义(x2=15.59，P<0.05)。

②TR+MMC组滤过道新生胶原纤维量少于TR组，两组差异有统计学意义(x2=16.10，P<0.05)。

③TR+S组和TR+MMC组术后滤过道新生胶原纤维量差异无统计学意义(x2=0.04，P>0.05)。

2.2 滤过道的天狼猩红染色观察及胶原定量分析

胶原天狼猩红染色呈玫瑰红色，在普通显微镜下根据胶原的含量呈卷发、丝网状、波浪状、粗大状、集聚成块状等。TR+S组和TR+MMC组结膜下间隙，巩膜间隙新生胶原染色浅，以疏网状、带状、波浪状胶原为主(见图2)。TR组新生胶原以致密条束状、块状为主，纵横交错、排列紊乱。

HMIAS-2000图像分析仪对天狼猩红染色后胶原的面密度和A值分析结果：三组面密度值比较，差异具有统计学意义(F=108.12，P<0.05)。进一步进行SNK比较，TR+S组和TR+MMC与TR组比较，差异均有统计学意义，而该两组间差异无统计学意义。三组A值进行方差分析，差异有统计学意义(x2=2.41，P=0.29)。见表2。

2.3 滤过道的成纤维细胞量 滤过道病理切片苏木素—伊红染色和鼠抗人波形蛋白单克隆抗体的免疫组化染色后，光镜下观察滤过道成纤维细胞量。结果显示，三种不同术式后成纤维细胞量均不同程度增多(见图3)。分级后，应用K-W 检验法进行统计学分析发现，各组间成纤维细胞量差异有统计学意义(x2=11.98，P<0.05)。结果表明三种不同手术方式对术后滤过道成纤维细胞量均有影响(见表3)。进一步两两分析比较(Nemenyi法)后可知：

①TR+S组成纤维细胞量少于TR组，两组间差异有统计学意义(x2=10.62，P<0.05)。

②TR+MMC组成纤维细胞量少于TR组，两组间差异有统计学意义(x2=10.35，P<0.05)。

③TR+S组与TR+MMC组术后成纤维细胞量差异无统计学意义(x2=0.02，P>0.05)。

2.4 滤过道的新生血管量 滤过道病理切片经第Ⅷ因子单克隆抗体免疫组化光镜观察，结果显示，三组不同手术后的兔眼滤过道都有不同程度的新生血管(x2=13.00，见图4)。TR组的新生血管较TR+MMC和TR+S组多，差异具有统计学意义(x2=5.19); TR+S组、TR+MMC组滤过道的新生血管量差异无统计学意义(x2=11.30，P>0.05)，见表4。

3 讨论

苏拉明是一种多磺酸萘醌盐，20世纪初期被用于临床治疗非洲锥虫病和丝虫病，20世纪80年代开始用于艾滋病的防治研究。近年来，苏拉明被发现在血管内膜增生狭窄、自身免疫性疾病及慢性阻塞性肺疾病甚至肿瘤等疾病防治中都能发挥其广泛的功能。在眼科研究领域中，Mietz等[8]和Huang等[9]应用酶联免疫吸附剂沉淀法测出,苏拉明能显著抑制人眼成纤维细胞分泌胶原的能力，在整个实验过程中对细胞的蛋白质无毒副作用。

青光眼滤过术常见的并发症是术后数月内手术区结膜—Tenon囊—巩膜水平的成纤维细胞过度增生，胶原沉积，滤过区瘢痕化，滤过道堵塞，导致手术失败。在术后伤口的修复过程中，大量生长因子和细胞因子的释放，可以和转化生长因子、血小板源性生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等多种生长因子受体结合并抑制其活性[10]，减少某些生长因子受体的表达,还可解离已与受体结合的生长因子[11]。因此，采用生长因子抑制剂苏拉明作用于青光眼滤过泡内的组织来研究该药物是否可作为青光眼滤过术后抗瘢痕形成的辅助用药。

本实验证实，500 μg/ml的苏拉明作用于家兔滤过泡内组织能明显减少成纤维细胞的增殖、新生胶原纤维的增生和新生血管的形成，其作用效力与目前临床应用的丝裂霉素相当。在预实验中，我们用MTT法证实500 μg/ml的苏拉明对细胞增殖有明显的抑制作用，在24 h后即发生作用;400 μg/ml的苏拉明在48 h后发生作用;300 μg/ml的苏拉明在72 h后才有显著性差异。但是应用丝裂霉素的患者由于睫状体上皮细胞的代谢受到影响，可出现长期的低眼压，角膜内皮和上皮细胞也容易受到影响从而出现相应的并发症。本实验未检测苏拉明对睫状体上皮细胞和角膜细胞的影响，因此，苏拉明对眼内细胞的毒副作用需要我们在今后的实验中继续观察。如果研究结果表明，苏拉明对眼内细胞的影响远较丝裂霉素小，则苏拉明可成为青光眼滤过术抗瘢痕形成的辅助用药的新方向。

【参考文献】

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