多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗诱导小鼠的免疫保护力观察

作者                    作者单位

李文桂    重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所,重庆400016

王鸿      重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所,重庆400016

朱佑明　　重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所,重庆400016

中图法分类号:R383. 3;R392. 11;R392. 7　　　文献标识码:A

Protective effect of immunization with m ixed recombinantBCG-EmⅡ/3 and BCG-

Em14-3-3 vaccine againstEchinococcusmultilocularisin m ice

LIWen-gui,WANGHong,ZHUYou-ming(Institute of Infectious and Parasitic Diseases,The FirstAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing 400016,China)

Abstract:Objective　To investigate the protection by immunization withmix recombinantBCG-EmⅡ/3and BCG-Em14-3-3 vaccine ofEchinococcusmultilocularis(Em)and against challenge ofEm protoscolexes.Methods　BALB/C micewere subcutaneously or intranasally vaccinatedwithmixed recombinantBCG vaccinesrespectively. Eightweeks later,the immunizedmicewere challengedwith Em protoscolexes. On the 18thweekafter vaccination,themicewere killed to count the rate of reduced alveolar echinococcusweightand to examinethe levels of IgG and its subclasses,IgE;the spleen cells were separated to measure subsets of CD4+andCD8+T cellsbyFACsor.t Blank vector,BCG and PBS served as contro.lResults　In the immunized groups,the rate ofreduced alveolarechinococcusweightwas45. 29% -76. 47%;the levels of IgG,IgG2a,IgG2b andIgE increased apparently while IgG1 and IgG3 decreased remarkably;CD4+subset and the ratio of CD4+/CD8+increased obviously,butCD8+subsethad no change.Conclusion　Intranasal ccinationwithmix re-combinantBCG-EmⅡ/3 and BCG-Em14-3-3 vaccine is a goodway forimmunization. IgG,IgG2a,IgG2b,IgEand CD4+T cell subsetmay play an important role in protecting against challenge ofEm protoscolexes.

Key words:Echinococcusmultilocularis;recombinantBCG-EmⅡ/3 vaccine;recombinantBCG-Em14-3-

3 vaccine;protection

泡型包虫病(alveolar echinococcosis, AE)是由多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis, Em)的续绦期幼虫寄生在人体肝脏引起的一种严重危害人类健康的人畜共患寄生虫病,研制疫苗是防治该病的有效途径之一。当前分子生物学技术的发展为研制理想的Em疫苗提供了新方法,将Em外源DNA引入特定疫苗载体构建重组活疫苗可将保护性抗原传递至宿主免疫系统。王昌源等[1]发现EmⅡ/3重组抗原(ELP蛋白)是一种有较好保护性免疫力的抗原分子, Siles等[2]发现Em14-3-3抗原位于Em原头蚴的生发层,其过度表达与原头蚴的进行性、侵入性和无限制生长特性有关,提示它是一种有希望的疫苗分子。Cirillo等认为卡介苗(Bacille Calmette-Guerin, BCG)是一种理想的疫苗载体,Matsuo等在BCG中成功构建了外源抗原分泌系统,这为发展BCG成为多价疫苗载体打下了坚实的基础。本研究在成功构建重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗的基础上[3, 4],将这两种疫苗按1∶1的浓度比例混匀,组成混合疫苗后免疫小鼠,原头节攻击后观察其诱导的减蚴率和抗体水平以及脾CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的变化,从而为研究混合重组BCG疫苗的保护性免疫机制提供有价值的材料。

1　材料与方法

1. 1　材料

1. 1. 1　实验动物

65只雌性BALB/c小鼠, 12~14周龄,平均体质量(22±3)g,购自重庆医科大学实验动物中心。

1. 1. 2　多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗

由本室构建[3, 4],将rBCG-EmⅡ/3和rBCG-Em14-3-3疫苗按1∶1的浓度比例混匀,组成混合疫苗。

1. 1. 3　主要试剂

HRP标记的羊抗小鼠IgE、IgG、IgG1、IgG3、IgG2a和IgG2b购自Southern Biotech公司。ConA购自Sigma公司,大鼠抗小鼠CD4+和CD8+T细胞亚群单克隆抗体以及FITC标记兔抗大鼠IgG抗体购自北京邦定泰克生物技术有限公司。泡球蚴粗抗原由本室制备。

1. 2　方法

1. 2. 1　实验分组

65只雌性BALB/c小鼠随机数字表法分为5组,每组13只。第1组为5×106CFU混合疫苗悬浮于100μlPBS于小鼠后背部皮下单次注射;第2组为5×105CFU混合疫苗悬浮于10μlPBS于小鼠鼻腔黏膜单次接种;第3组为5×

106CFU的空载体(含pBCG质粒的BCG)皮下注射对照组;第4组为5×106CFU的BCG皮下注射对照组;第5组为100μlPBS皮下注射对照。

1. 2. 2　攻击感染

多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫后8周用50个泡球蚴原头节腹腔内注射进行攻击。

1. 2. 3　减蚴率计算

攻击感染后18周剖杀各组小鼠,切开小鼠腹部,仔细分离泡球蚴组织,称质量,计算减蚴率。其公式为:减蚴率(% )=(1-免疫组检获泡球蚴质量/对照组检获泡球蚴质量)×100%。

1. 2. 4　血清收集和抗体检测

小鼠接种疫苗前和接种疫苗后8周从尾静脉采血,原头节攻击感染后18周从眼球采血,室温静置12 h, 2 000 r/min离心10min,分离血清, -20℃冰箱冻存。常规ELISA检测IgG及其亚类和IgE抗体。

1. 2. 5　脾细胞制备

按参考文献[6]进行。

1. 2. 6　脾细胞CD4+和CD8+亚群制备

吸取1×106脾细胞至1. 5 mlEp管,加入大鼠抗小鼠CD4+或CD8+亚群单抗50μ,l 4℃放置30 min;加入FITC标记兔抗大鼠IgG抗体50μ,l 4℃放置30 min;每管加入1%多聚甲醛100μl进行固定, 4℃保存。

1. 2. 7　脾细胞CD4+和CD8+亚群检测

用FACsort流式细胞仪于523 nm波长下测定细胞绿色荧光,每个样本计数1×104个细胞,分析软件为ModFitLT。

1. 3　统计学处理

采用SPSS 11. 0统计软件进行计量资料t检验或方差分析;组间两两比较用SNK法。计数资料用χ2检验。

2　结果

2. 1　减蚴率计算

106CFU混合重组BCG疫苗皮下注射免疫小鼠后,减蚴率为45. 29%,与PBS对照组相比,差异显著(P<0. 05); 105CFU混合重组BCG疫苗鼻腔内接种免疫小鼠后,减蚴率为76·47%,与PBS对照组相比,差异极显著(P<0. 01);鼻腔内接种组减蚴率显著高于疫苗皮下注射组(P<0. 01);空载体和BCG皮下注射组的减蚴率分别与PBS对照组相比,差异均不显著(P>0. 05),见表1。

表1　混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫和原头

节攻击后小鼠减蚴率检测(n=8)

组别　　　检获包囊质量(g,-x±s)减蚴率(% )

疫苗皮下注射组0. 93±0. 39 45. 29a

疫苗鼻腔内接种组0. 40±0. 37 76. 47b

空载体对照组1. 49±0. 48 12. 35

BCG对照组1. 51±0. 39 11. 18

PBS对照组1. 70±1. 28…

a:P<0. 05,b:P<0. 01,与PBS对照组比较;b:P<0. 01,与疫苗皮下注射组比较

2. 2　IgG及其亚类和IgE检测

小鼠血清IgG、IgG2a和IgG2b在疫苗接种后8周以及疫苗免疫和原头节攻击后18周与0周相比均显著增加,统计学分析发现差异有显著或极显著意义(P<0. 05,P<0. 01),疫苗免疫和原头节攻击后18周小鼠血清IgG2a与疫苗接种后8周相比明显升高(P<0·01);小鼠血清IgG1在疫苗接种后8周与0周相比均显著降低,统计学分析显示差异有极显著意义(P<0·01),疫苗免疫和原头节攻击后18周小鼠血清IgG1水平与疫苗接种后8周相比明显增加(P<0·01);小鼠血清IgG3在疫苗接种后8周与0周相比明显降低(P<0. 01), IgG3在疫苗免疫和原头节攻击后18周与0周相比轻微降低(P>0. 05),疫苗免疫和原头节攻击后18周小鼠血清IgG3水平与疫苗接种后8周相比轻微增加(P>0. 05);小鼠血清IgE水平在疫苗接1277种后8周较0周显著升高,统计学分析显示差异有极显著意义(P<0. 01),疫苗免疫和原头节攻击后18周小鼠血清IgE水平分别与疫苗接种后8周和0周相比明显降低(P<0. 05,P<0·01),见表2。

表2　混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗鼻腔内接种和原头节攻击后小鼠血清Ig检测(n=8,-x±s)

组别0周8周18周

IgG 0. 034±0. 010 0. 081±0. 018b0. 092±0. 003b

IgG2a 0. 012±0. 004 0. 018±0. 002a0. 026±0. 004bc

IgG2b 0. 014±0. 006 0. 021±0. 003b0. 021±0. 004a

IgG1 0. 192±0. 008 0. 039±0. 006b0. 205±0. 034c

IgG3 0. 175±0. 031 0. 141±0. 010b0. 158±0. 024

IgE 0. 024±0. 003 0. 143±0. 003b0. 020±0. 003ac

a:P<0. 05,b:P<0. 01,与0周比较;c:P<0. 01,与8周比较

2. 3　脾细胞

106CFU混合重组BCG疫苗皮下注射免疫小鼠后,脾细胞CD4+亚群百分比为33. 58%,与PBS对照组相比显著升高,差别有显著意义(P<0. 01); 105CFU疫苗鼻腔内接种免疫小鼠后,脾细胞CD4+亚群百分比为31. 05%,明显高于PBS对照组(P<0. 01);疫苗皮下注射组的脾细胞CD4+亚群百分比明显高于疫苗鼻腔内接种组(P<0. 01);空载体和BCG皮下注射组的脾细胞CD4+亚群百分比分别与PBS对照组相比,差别均无显著意义(P>0. 05),见表3。

2. 4　脾细胞CD8+亚群百分比变化

皮下注射组和鼻腔内接种组的脾细胞CD8+亚群百分比与PBS对照组相比无明显变化(P>0. 05);疫苗皮下注射组的脾细胞CD8+亚群百分比与疫苗鼻腔内接种组比较无显著差别(P>0. 05);空载体和BCG皮下注射组的脾细胞CD8+亚群百分比分别与PBS对照组相比,差别均无显著意义(P>0. 05),见表3。

2. 5　脾细胞CD4+/CD8+亚群比值变化

疫苗皮下注射组或鼻腔内接种组的CD4+/CD8+亚群比值显著高于PBS对照组(P<0. 01);空载体和BCG皮下注射组的CD4+/CD8+亚群比值分别与PBS对照组相比,差别均无显著意义(P>0. 05),见表3。

表3　重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫,原头节攻击后小鼠脾细胞亚群检测(n=8)

组别CD4+亚群百分比CD8+亚群百分比CD4+/CD8+亚群比值疫苗皮下注射组0.336±0.005bc0.092±0.006 3.67±0.26b

疫苗鼻腔内接种组0.310±0.011b0.090±0.006 3.47±0.63b

空载体对照0.236±0.017 0.091±0.013 2.62±0.29

BCG对照0.244±0.023a0.096±0.006 2.55±0.35

PBS对照0.216±0.027 0.085±0.018 2.75±1.08

a:P<0. 05,b:P<0. 01,与PBS对照组比较;c:P<0. 01,与鼻腔内接种组比较

3　讨论

Reuben等用10~107CFU的BCG腹腔内注射免疫棉鼠(Sigmodon hispidus),然后用1个Em育囊腹腔内注射进行攻击,发现10 CFU的BCG免疫组不产生保护力, 102CFU的BCG免疫组可产生部分保护力,而103~107CFU的BCG免疫组可产生完全保护力,推测BCG可激活腹腔巨噬细胞,从而杀伤Em的原头节。本研究表明空载体和BCG皮下注射组可诱导11. 18%~12. 35%的减蚴率,表明BCG对Em原头节具有一定的杀伤作用。

温浩等发现94%的AE患者血清IgG升高,抗体亚类分析显示84%患者IgG4升高, 58%患者IgG1增加,但IgG2和IgG3降低;Gottstein等证实C57BL/6j鼠在感染泡球蚴90 d后IgG1升高,但IgG2a降低;当将重组St-EmⅡ/3-10疫苗采用皮下注射和口服免疫分别接种C57BL/6J鼠和犬时发现免疫鼠和犬的血清抗EmII/3-10特异性抗体显著升高,但免疫犬的特异性抗体水平高于免疫鼠;王昌源等[1]用100μg的EmⅡ/3重组抗原(ELP蛋白)皮下注射免疫BALB/c鼠3次后发现首次免疫后2周鼠血清IgG1明显增加,当加用弗氏佐剂时鼠血清IgG2b轻微增加。由于小鼠MHC分子的多样性和多房棘球绦虫抗原结构的复杂性,小鼠将针对抗原的多个表位产生免疫反应,使得单一抗原成分(EmⅡ/3或Em14-3-3)诱导宿主产生的保护性免疫应答效果往往较低,因此,本研究将重组BCG-Em

Ⅱ/3和BCG-Em14-3-3疫苗按1∶1的浓度比例混匀,组成混合疫苗后免疫小鼠,原头节攻击后观察其诱导的抗体水平,发现小鼠血清IgG、IgG2a和IgG2b在疫苗接种后8周显著增加,提示IgG、IgG2a和IgG2b可能参与疫苗诱导的保护性免疫反应;小鼠血清IgG1和IgG3在疫苗接种后8周明显降低,表明IgG1和IgG3可能与泡球蚴病的易感性有关。

Vuitton等发现30例AE患者血清IgE升高,李富荣等[5]证实35例AE患者经阿苯哒唑治疗后血清IgE明显下降。本研究用混合重组BCG疫苗鼻腔内接种小鼠8周后发现小鼠血清IgE水平在疫苗接种后8周显著升高,在疫苗免疫和原头节攻击后18周显著降低,与上述结果不同。推测升高的IgE可通过激活小鼠体内的肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和血小板,释放主要碱性蛋白、阳离子蛋白和过氧化氢等生物活性物质,发挥非特异性杀伤Em原头节的效应; IgE还可通过抗体依赖的补体介导的细胞毒作用,发挥特异性杀伤Em原头节的效应,但IgE可通过肥大细胞介导的I型变态反应对宿主组织造成损伤作用。

李文桂等[6]研究测得正常BALB/c鼠脾CD4+T细胞亚群百分比为24. 11%, CD8+T细胞亚群百分比为5. 97%,本研究表明BALB/c鼠感染Em原头节后,CD4+T细胞亚群百分比为21. 63%,CD8+T细胞亚群百分比为8. 48%,可见Em感染可降低小鼠的CD4+T细胞数目,轻微增加CD8+T细胞数目。BCG皮下注射组和空载体对照组CD4+和CD8+T细胞亚群百分比与感染对照组相比均轻微增加,提示BCG免疫对Em感染具有一定的免疫调节作用。

Gottstein等将重组St-EmⅡ/3-10疫苗采用皮下注射和口服免疫分别接种C57BL/6J鼠和犬时发现免疫鼠和犬的脾淋巴细胞明显增多;王昌源等[1]用100μg的EmⅡ/3重组抗原(ELP蛋白)皮下注射免疫BALB/c鼠3次后发现首次免疫后2周免疫鼠脾细胞在EmAg或ConA刺激下明显增殖;Dai等[7]发现小鼠缺乏功能性αβ+CD4+T细胞亚群时,体内泡球蚴生长迅速,且无肉芽肿形成,脾细胞增殖降低,提示该细胞在抑制泡球蚴生长过程中起关键作用;Manfras等[8]发现有明显症状的AE患者外周血单核细胞增殖明显降低,CD4+T细胞亚群明显减少, D8+T细胞亚群显著增多;李富荣等[9, 10]证实泡球蚴感染BALB/c鼠后1~8周以CD4+T细胞增多为主,随后CD4+T细胞开始减少,CD8+T细胞开始增加, 20周后改变明显,CD4+/CD8+亚群比值迅速倒置;感染泡球蚴25周的小鼠脾CD4+T细胞凋亡明显增加;AE患者体内CD4+T细胞明显减少,CD8+T细胞显著增加, CD4+/CD8+亚群比值倒置,当用阿苯哒唑进行治疗时发现疗程达1年的AE患者体内CD8+T细胞继续增加,疗程达2年的患者体内CD4+T细胞开始增加,CD8+T细胞开始下降,CD4+/CD8+亚群比值升高。本研究显示皮下注射组和鼻腔内接种组小鼠脾D4+T细胞显著增加,推测疫苗分泌的EmⅡ/3或Em14-3-3抗原经抗原提呈细胞加工处理后,形成13~17个氨基酸残基组成的抗原肽,该肽与MHCⅡ类分子连接形成抗原肽———MHCⅡ类分子复合物,经高尔基体运送到APC表面,与CD4+T细胞受体结合,活化CD4+T细胞。活化的CD4+T细胞增殖分化,形成效应性Th细胞,其中Th1细胞分泌IL-2和IFN-γ,促进TDTH和Tc细胞的增殖分化和成熟,在细胞介导的免疫应答中发挥作用;Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10,促进B细胞的增殖分化和抗体形成,在抗体介导的免疫应答中发挥作用;活化的CD4+T细胞后可激活巨噬细胞和NK细胞,从而增强它们杀伤泡球蚴的作用[11, 12]。

本研究用混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗皮下注射或鼻腔内接种免疫小鼠后,可诱导45·29% ~76. 47%的减蚴率,推测疫苗免疫后可诱导小鼠血清产生高水平的IgG、IgG2a和IgG2b和IgE,这些抗体及其亚类均可杀伤Em原头节,从而减轻泡球蚴的重量。鼻腔内接种组的减蚴率明显高于皮下注射组,提示疫苗鼻腔内接种是一种较好的免疫途径。

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