基于hxgprt-缺陷的弓形虫顶质体荧光突变株的构建

作者         作者单位

吴亮    江苏大学基础医学与医学技术学院

姜旭淦  江苏大学基础医学与医学技术学院

李礼    江苏大学基础医学与医学技术学院

鞠爱萍　江苏大学基础医学与医学技术学院

[Abstract]　Objective： To construct Toxoplasma gondii(T. gondii) mutant for expression of green fluorescent protein (GFP) in apicoplast and establish the simple methods for apicoplast detection. Methods： Acyl carrier protein (ACP) gene was amplified from T. gondii genomic DNA and used to construct the transfection plasmid pHX-ACP-GFP， which was transfected into T. gondii tachyzoites. The mutant was selected by mycophenolic acid and xanthine. The expression of GFP was detected by confocal microscope and Western blotting. Results： The mutant was selected by mycophenolic acid and xanthine for one week. The green fluorescent aggregated in apicoplast was observed by confocal microscope. The transit peptide and mature ACPs were detected using anti-GFP tag antibody by Western blotting. Conclusion： Apicoplast could be labeled by ACP-GFP fusion protein which was detected by anti-GFP tag antibody.

[Key words]　Toxoplasma gondii; apicoplast; mutant; green fluorescent protein

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是重要的人兽共患寄生虫，全球近1/3人口被感染[1]。免疫功能正常人群感染弓形虫并不会出现明显症状，但免疫功能降低或免疫功能缺陷患者感染则可以引发严重并发症，目前弓形虫感染已成为器官移植和AIDS患者重要死亡因素之一[2]。现有的抗弓形虫药物对急性弓形虫病治疗效果较好，但无法杀灭存在于组织内包囊状态的虫体，治疗后复发率高，临床急需一种新型高效药物用于弓形虫病治疗[3]。

顶质体(apicoplast)是顶复门寄生虫(除隐孢子虫)的一种类似植物叶绿体样质体，人类及其他哺乳动物细胞中并无该质体。顶质体为新型抗虫药物的研制提供了理想靶点，已引起国内外学者的广泛关注[4]。顶质体在普通光学显微镜下无法观察，需借助电子显微镜等特殊设备，给顶质体研究带来了一定困难。本研究通过基因重组技术，将弓形虫顶质体蛋白——酰基载体蛋白(acyl carrier protein， ACP)与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein， GFP)融合用于标记顶质体，建立检测虫体内顶质体的方法，为后续研究提供技术保障。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　虫株

弓形虫次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-xanthine guanine-phosphoribosyl transferase，HXGPRT)缺陷株(hxgprt-)由瑞士日内瓦大学Dominique Soldati教授惠赠。

1.1.2　细胞

HeLa细胞为本室保存，培养于含10%新生牛血清RPMI 1640培养液，胰酶消化传代培养于37℃ 5% CO2细胞培养箱中[5]。

1.1.3　菌种与质粒

弓形虫转染质体pHX-P30-GFP由美国西雅图生物医学研究所Amy DeRocher博士惠赠。pTG19-T载体购自上海捷瑞生物技术有限公司，大肠埃希菌(E. coil)DH5α株由本室保存。

1.1.4　主要试剂和仪器

RPMI 1640培养液购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，小牛血清和胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，三磷酸腺苷二钠(ATP-Na2)、还原型谷光苷肽购自美国Sigma公司。胰蛋白胨和酵母提取物购自美国Oxoid公司。霉酚酸(mycophenolic acid， MPA)和黄嘌呤(xanthine， XAN)购自美国Sigma公司。去内毒素质粒大量抽提试剂盒购自美国Promega公司，PCR预混液购自北京百泰克生物技术有限公司。限制性内切酶购自立陶宛Fermentas公司，T4连接酶购自宝生物(大连)有限公司。基因组DNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒和DNA标准参照物购自上海捷瑞生物技术有限公司。兔抗GFP多克隆抗体购自北京奥博森生物技术有限公司。辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(HRP-IgG)、FITC标记羊抗兔IgG(FITC-IgG)、抗荧光淬灭封片剂和硝酸纤维素膜(NC膜)购自武汉博士德公司。电转仪(MicroPulser)和电转杯(直径2 mm)购自美国Bio-Rad公司。激光共聚焦显微镜为德国Leica公司产品。

1.2　方法

1.2.1　弓形虫的培养及基因组DNA提取

弓形虫hxgprt-株速殖子培养于HeLa细胞中[5]，待虫体涨破细胞后，收集虫体，以无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline， PBS)洗涤2次，按试剂盒操作方法提取虫体基因组DNA，保存于-20℃备用。

1.2.2　acp基因扩增与克隆

根据ToxoDB基因库中弓形虫RH株基因组acp基因序列设计引物，交由上海捷瑞生物技术有限公司合成。ACP-F： 5′-TCATGAAGATCTATGGAGATGCATCCCCGCAACG-3′(BglII);ACP-R：5′-GATCGACCTAGGCTTGGCTTTCTC GATATAGCTCAGAGCGTC-3′(AvrII)。以弓形虫基因组DNA为模板PCR扩增，条件：94℃预变性1 min,94℃ 30 s,60℃ 90 s,72℃ 90 s，循环30次，72℃ 延伸10 min，产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。胶回收试剂盒回收PCR产物，与pTG19-T载体4℃连接过夜。连接产物转化感受态DH5α，涂布于含100 μg/ml 氨苄西林、200 μg/ml X-Gal和100 μg/ml IPTG的LB琼脂平板(含10 g/L NaCl,10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物和15 g/L琼脂),37℃培养过夜。次日挑取白色菌落转入液体LB培养基(含10 g/L NaCl,10 g/L胰蛋白胨和5 g/L酵母提取物)增菌，提取质粒，经PCR和双酶切鉴定，阳性质粒送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果正确的质粒用于后续实验。

1.2.3　pHX-ACP-GFP转染载体的构建

质粒ACP-pTG19-T和 pHX-P30-GFP分别以BglII 和AvrII酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳分离回收ACP插入片段和转染载体，T4连接酶16℃过夜连接。次日将连接产物转化感受态DH5α，涂布于含100 μg/ml 氨苄西林的LB琼脂平板，挑取单个菌落接种液体LB培养基增菌，提取质粒，经PCR和双酶切鉴定。

1.2.4　制备pHX-ACP-GFP弓形虫突变株

大量扩增含pHX-ACP-GFP质粒DH5α菌，以去内毒素质粒大量抽提试剂盒提取质粒，乙醇洗涤沉淀质粒DNA，溶解于20 μl灭菌双蒸水中备用。取体外培养的弓形虫速殖子，以Cytomix电转缓冲液[6]调节密度至3.3×107/ml，吸取300 μl速殖子悬液与50 μg质粒DNA充分混匀，转入2 mm电转杯中。1.5 kV，25 μF电击1次。电转后室温下静置1 min，立即接种HeLa细胞，加入含1%胎牛血清RPMI 1640培养液，置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养，24 h后分别加入终浓度为25 μg/ml MPA和50 μg/ml XAN，每日于倒置显微镜下观察2次，待虫体涨破细胞后转入新HeLa细胞中，直至筛选出可以稳定传代的突变株速殖子，再经极限稀释法[6]获得性状稳定的突变株。

1.2.5　激光共聚焦显微镜观察pHX-ACP-GFP弓形虫突变株

HeLa细胞中接种pHX-ACP-GFP突变株1×106/孔，24 h后PBS缓冲液洗涤2次以除去游离的速殖子，4%低聚甲醛室温固定5 min，经DAPI染色10 min后，滴加抗荧光淬灭封片剂于激光共聚焦显微镜下观察。

1.2.6　蛋白质印迹检测pHX-ACP-GFP突变株GFP蛋白表达

收集pHX-ACP-GFP突变株速殖子1×107个，于2×SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸5 min，取上清进行SDS-PAGE电泳，湿法转移至NC膜。5%脱脂奶粉中室温封闭1 h，兔抗GFP抗体(1 ∶100)室温孵育1 h，HRP-IgG(1 ∶5 000)室温孵育1 h，ECL发光试剂盒显影。

2　结果

2.1　acp基因克隆与转染质粒pHX-ACP-GFP的构建和鉴定

从弓形虫基因组DNA中扩增获得约1 400 bp产物(图1)。质粒ACP-pTG19-T经BamHⅠ酶切后在约1 400 bp处出现目的条带(图2)，基因测序结果证实插入目的片段序列与预期一致。转染质粒pHX-ACP-GFP经BglII和AvrII双酶切，在约1 400 bp处出现目的条带(图3)，与预期相符，表明转染质粒构建成功。M：DNA标准参照物;1：弓形虫基因组DNA;2：HeLa细胞基因组DNA图1　PCR扩增弓形虫acp基因图2　质粒ACP-pTG19-T酶切鉴定图3　质粒pHX-ACP-GFP酶切鉴定

2.2　激光共聚焦显微镜观察pHX-ACP-GFP突变株

激光共聚焦显微镜下以488 nm激发光可见绿色荧光聚集于顶质体，少部分绿色荧光分布于虫体核周围，虫体和宿主细胞核内无绿色荧光(图4)。A：顶质体绿色荧光;B：DAPI染色;C：A图与B图融合图4　pHX-ACP-GFP突变株激光共聚焦显微镜观察(1 000×)

2.3　蛋白质印迹检测pHX-ACP-GFP突变株GFP蛋白表达

抗GFP抗体可以识别51 000和45 000条带，分别为ACP蛋白的转运肽型(t-ACP)和成熟型(m-ACP)，未转染虫体未见上述条带(图5)。

3　讨论

顶质体是顶复门寄生虫内一种具有4层膜结构的细胞器，内含一个约35 000可自行复制的环状基因组DNA[7]。研究表明该质体起源于被顶复门寄生虫吞噬的蓝绿藻，在虫体内经长期内共生进化形成[8]。虽然在长期进化过程中顶质体的绝大部分基因已转移至虫体核基因组，但顶质体仍是虫体脂肪酸、类异戊二烯和血红素合成的场所，对虫体的存活和增殖具有重要意义，是一个潜在的抗虫药物作用靶点[4]。1：pHX-ACP-GFP突变株;2：hxgprt-缺陷株图5　pHX-ACP-GFP突变株ACP-GFP融合蛋白表达

顶质体研究对于新型抗虫药物的研制具有重要意义，但由于无法在普通光学显微镜下直接观察，同时也缺少明显的结构特征，以至于长期以来顶质体一直被研究者误认为是高尔基体而未被发现[9]。虽然透射电镜可以通过其重要鉴别标准—4层膜结构辨认顶质体，但为达到清晰分辨4层膜结构的效果，对电镜标本制备要求极为苛刻，显然无法在研究中常规使用。某些荧光染料如DAPI虽然可以与顶质体基因组DNA结合并发出荧光[10]，但其荧光强度弱，且与细胞核荧光无差别，实际使用中仍难以鉴别。因此建立一种快速简便的检测方法已成为顶质体研究中迫切需要解决的难题之一。

附加表位标签技术为顶质体的检测提供了一条新途径。弓形虫速殖子阶段为单倍体且可在体外连续传代培养，是基因转染操作的理想生物材料[11]。通过电转染法向速殖子导入转染质粒，将所研究的蛋白与附加表位标签融合是国外研究弓形虫基因与蛋白质功能的常用技术[12]，但国内目前仍未广泛使用。弓形虫电转染后为获得纯系突变株需进行筛选，常用的筛选标记有氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase，CAT)、二氢叶酸还原酶-胸苷酸合酶(dihydrofolate reductase-thymidylate synthase，DHFR-TS)和HXGPRT，其中HXGPRT是目前最理想的筛选标记[13]。使用HXGPRT筛选只需2～3天即可杀死未转染的虫体，而CAT则需要10～15天才能完全杀死未转染的虫体。虽然DHFR-TS也可以在2～3天内杀死未转染的虫体，但所获得的突变株对现有的抗弓形虫药物高度耐药，对研究者本身是一个潜在的危险。

在长期进化过程中顶质体大部分功能基因已转移至虫体核基因组中，但由核基因组编码的顶质体蛋白(如ACP)在翻译合成后仍转运至顶质体，因此，ACP等蛋白是顶质体的理想标记物。本研究采用向弓形虫速殖子电击转化pHX-ACP-GFP质粒的方法，将GFP荧光蛋白编码基因导入虫体基因组，使GFP荧光蛋白与顶质体蛋白ACP融合。研究结果显示，借助GFP荧光，在激光共聚焦显微镜下可以清晰地观察到虫体内顶质体，极大地方便了顶质体研究。

蛋白质印迹结果表明，抗GFP抗体可以识别弓形虫t-ACP和m-ACP，这与顶质体蛋白在虫体转运过程相吻合[14]。顶质体蛋白N-端有一种特殊双引导序列(bipartite targeting sequence， BTS)结构，BTS由一段信号肽(signal peptide， SP)和转运肽(transit peptide， TP)组成，顶质体蛋白先由SP引导进入内质网，切除SP成为转运肽型，在TP引导下进入顶质体，切除TP变为成熟型。采用蛋白质印迹技术，能检测出转运肽型和成熟型顶质体蛋白的表达量，以揭示该蛋白的转运情况。同时，借助抗GFP抗体，可以检测融合蛋白，而无需制备相应多克隆抗体，节省了实验周期和费用。

【参考文献】

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