应用间接原位PCR诊断弓形虫淋巴结炎

作者               作者单位

卢慎   江苏大学附属昆山医院实验室，江苏 昆山 215300

Application of the indirect in situ PCR on diagnosis of toxoplasmic lymphatitis

LU Shen

(Department of Laboratory, the Affiliated Kunshan Hospital of Jiangsu University， Kunshan Jiangsu 215300,China)

[Abstract] Objective: To research the indirect in situ PCR technology on the diagnosis of toxoplasmosis lymphadenitis.Methods： To design the toxoplasma gondii B1 gene primer, carry on the in situ PCR，hybridization with B1 gene digoxin probe after PCR, test the existence of toxoplasma gondii in the 86 cases which was diagnosed as chronic non-specificity lymphnoditis on pathologic standards. Results： In 86 cases of chronic non-specific lymphnoditis， used in situ PCR technology， 47 cases(54.65%) showed positive results，and there was no significant differences in the three groups (P>0.05). Conclusion： Toxoplasmosis lymphadenitis can be misdiagnosed as chronic non-specific lymphtitis if use the traditional pathologic method.

[Key words] toxoplasma gondii;lymphadenitis;indirect in situ PCR

弓形虫是一种专性细胞内寄生繁殖的原虫,又是一种机会感染性病原体,广泛分布于世界各地,其引起的弓形虫病为人兽共患病。由于该病无特异性体征与临床症状，临床难以确诊,常需实验室检测结果予以诊断。因而,弓形虫病的诊断至今仍是重点研究的课题之一。虽然国内有关弓形虫病诊断的研究有多篇文献[1-6]，也有应用间接或直接原位PCR进行弓形虫病诊断的研究,但仅用于实验动物[2,3]。本文应用间接原位PCR技术，检测人病理诊断为慢性非特异性淋巴结炎组织中的弓形虫。

1 材料与方法

1.1 材 料

随机取1999年～2000年内蒙古某医院50例、北京某医院23例及本院13例，病理诊断为慢性非特异性淋巴结炎病例的蜡块，共86例96个蜡块，其中10例取自两个不同部位的淋巴结制作成2个蜡块。男51例，女35例，年龄13～71岁。临床均需明确淋巴结肿大病因，而切取淋巴结活检。所有标本均经10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，连续切片，片厚5 μm。

1.2 方 法

间接原位PCR方法见参考文献[2]。

1.2.1 引物序列 引物1：5′-GGAACTGCATCCGTTCATGAG-3′;引物2：5′-TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC-3′。引物由美国CyberSyn公司合成(经OPC)纯化，扩增产物长194 bp。

1.2.2 探针 5′-GGC GAC CAA TCT GCG AAT ACA CC-3′。在5′端标记地高辛(美国CyberSyn公司)。

1.2.3 仪器 实验所用的原位PCR扩增仪为美国PE Cetus公司生产的PE1000型原位PCR扩增仪。

1.2.4 标本预处理 石蜡切片标本常规脱蜡、水化，经稀盐酸(0.2 mol/L HCl)酸化处理，用蛋白酶K(Merck公司产品。0.1 mol/L Tris-HCl, pH 8.0，50 mmol/L EDTA，pH 8.0配制，工作浓度为50 μg/ml)于37 ℃消化15 min，以0.2%甘氨酸终止反应后经乙醇逐级脱水，风干备用。洗涤液为TBS。

1.2.5原位扩增 预处理后的标本置于PE公司与原位扩增仪配套的专用封片机上，在热启动(94℃)条件下滴加PCR扩增反应液，封片后在PE1000原位扩增仪上扩增。反应总体积为50 μl，含有10 mmol/L Tris-HCl(pH 9.0，25℃)，50 mmol/L KCl，3 μg/ml BSA，2.5 mmol/L MgCl2，0.1% Triton X-100、引物各1 μmol/L，Taq DNA聚合酶(购自Promega公司)4U，dATP，dCTP，dGTP，dTTP(购自Sigma公司)各200 μmol/L，反应参数为：94℃变性7 min，三温循环为94℃ 2 min，60℃ 2 min，72℃ 3 min，循环次数为30次，末次延伸72℃ 7 min。

1.2.6 扩增后杂交 切片充分洗涤，用无水乙醇后固定，风干后用不含探针的杂交液孵育(去离子甲酰胺20%硫酸葡聚糖500 μl，20% SSC 100 μl，10 mg/ml 鲱鱼精子DNA 100 μl，20 mg/ml BSA 100 μl)2 h，滴加2.5 μg/ml地高辛标记的探针杂交液，95℃变性5 min，37℃杂交过夜。经50%去离子甲酰胺2×SSC(1∶1)37℃ 5 min, 2×SSC 37℃30 min, 0.5×SSC 37℃1 min 4次，PBS洗。

1.2.7 免疫组化显色 滴加小鼠抗地高辛抗体(购自北京中山公司)37℃孵育2 h，PBS洗，5 min 3次，滴加HRP标记的羊抗小鼠的抗体，37℃孵育20 min，PBS洗，5 min 3次，DAB(Dako公司产品)显色。苏木素复染，常规脱水、透明、封固。每次实验用已知小鼠脾组织弓形虫阳性片为阳性对照片。阴性对照：设立无Taq酶、无探针及检测系统对照，同时检测正常小鼠脾组织切片为已知阴性对照。

1.3 结果判断

在淋巴结组织中的任何有核细胞的质或(及)核内，或(及)间质内见棕黄色呈弓形、弧形、椭圆形散在或聚集成堆为弓形虫阳性标志物。

1.4 统计学处理

数据用χ2检验。

2 结果

86例中弓形虫阳性47例,占54.65%。弓形虫棕黄色阳性标志物分布于淋巴结的皮质及髓质，主要位于免疫细胞质或(及)间质内，呈弓形、弧形、椭圆形，多聚集成堆。淋巴小结套层与生发中心，滤泡间区均散在分布有弓形虫棕黄色阳性标志物(图1)。此外,10例取自两个不同部位淋巴结而制作2个蜡块的病例中，弓形虫阳性7例,其中4例仅1个部位淋巴结的蜡块切片组织中弓形虫阳性，另1个部位淋巴结的蜡块切片组织中弓形虫呈阴性(图2)。3所医院的弓形虫阳性率经统计学处理无明显差异(P>0.05)，见表1。

表1 间接原位PCR检测3所医院淋巴结组织中弓形虫的结果(略)

Tab 1 Result of the indirect situ PCT testing the　existence of toxoplasma gondii in the 86 cases

3所医院对照χ2= 0.4441， P>0.05

3 讨论

弓形虫病的病理诊断其实质即是病原学诊断,其原因不仅是病原体弓形虫是一种专性细胞内寄生繁殖的原虫,凡寄生虫病的诊断必须查见虫体才能确诊,而且弓形虫病的病理变化并无特异性可作为病理诊断的依据。弓形虫可随血流波及全身,导致单个或多个器官组织病变,因此,弓形虫病的临床类型众多。弓形虫淋巴结炎是弓形虫病最常见的临床类型之一,且弓形虫病其他临床类型也常伴随淋巴结病变。淋巴结活检明确病因，是临床医师常用的诊断手段，也是病理科日常诊断工作中常见的病理标本之一。但在HE染色的淋巴结组织切片中,难以确认弓形虫,其原因在于弓形虫淋巴结炎的病理变化,为非特异性炎性病变。而弓形虫虫体随着组织，经过固定脱水后发生收缩而缩小,且弓形虫体在组织中的位置各异,切片角度不同,形态多样,在显微镜下难以查见呈弓形、香蕉形、弧形典型的虫体[7]。

原位PCR技术把PCR和原位杂交技术的优点相结合,有效地解决了这两种方法的不足,既可检测出低拷贝至单个拷贝的DNA和RNA,又可特异地确定其细胞来源和细胞内定位。原位PCR分为直接原位PCR与间接原位PCR两种,前者容易出现假阳性,后者由于是在没有标记物的情况下进行PCR反应,扩增反应结束后,再用原位杂交技术来检测扩增的信号,克服了由于DNA修复或引物错配引起的非特异性问题,因而该方法被广泛应用于外源基因检测,包括细菌、真菌、病毒等引起的疾病中病原体的检测,以及人工转基因的检测和基因变异的研究、基因表达及定位的研究[8]。本实验应用间接原位PCR检测病理诊断为慢性非特异性淋巴结炎组织中的弓形虫,86例中有47例阳性,占54.65%。在每次实验中设立了用已知小鼠脾组织弓形虫阳性片为阳性对照片。阴性对照：设立无Taq酶、无探针及检测系统对照，同时检测正常小鼠脾组织切片为已知阴性对照。引物与探针采用弓形虫B1基因，因该基因是一种多拷贝基因且序列高度保守及重复。为提高灵敏度与特异性，用蛋白酶进行预处理，采用热启动PCR,用1对引物使靶基因有效扩增，加入Taq酶和引物，避免了假阳性，每张片子背景清晰,无非特异性着色。3所医院弓形虫阳性率经统计学处理差异无统计学意义,说明在本实验中的弓形虫阳性率不存在地域差异。但在10例取自两个不同部位处的淋巴结，分别包埋制作成2个蜡块的病例中，弓形虫阳性7例，其中4例仅1个部位淋巴结的蜡块切片组织中弓形虫阳性，另1个部位淋巴结的蜡块切片组织中弓形虫呈阴性,其原因是否涉及弓形虫在淋巴结中的分布有无规律性?尚有待于进一步收集资料在实验中去探索证实。本实验应用间接原位PCR技术检测病理诊断为慢性非特异性淋巴结炎病例，证实存在有相当部份弓形虫淋巴结炎病例被误诊，应引起临床及病理学界的重视。

(本文图1,图2见彩色插图)(略)

【参考文献】

[1] 卢 慎，马以武.应用免疫酶标记技术诊断弓形虫病[J].中华病理学杂志，1987,16(3)：228.

[2] 李 爽，甘绍伯，彭瑞云，等.间接原位PCR检测实验性弓形虫感染病理标本[J].寄生虫与医学昆虫学报,2000,7(2)：65-69.

[3] 李 爽，甘绍伯，彭瑞云，等.原位PCR对弓形虫感染鼠病理检测效果的观察[J].中国人兽共患病杂志,2000,16(3)：41-43.

[4] 史晓燕，赵恒梅，曾宪忠，等.RNA原位杂交法检测组织内弓形虫的实验研究[J].中国人兽共患病杂志,2004,20(3)：214-216.

[5] 刘俊燕，杨秀珍，吴增强，等.间接免疫酶染色检测小鼠组织内弓形虫及抗原[J].天津医科大学学报,2005,11(3)：356-358.

[6] 刘翠梅，欧阳颗，谭德明，等.核酸原位杂交检测人淋巴结组织中的弓形虫[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1998,16(5)：380-383.

[7] 卢 慎.弓形虫在病理切片组织中的的形态学研究[J].中国人兽共患病杂志,1991,7(5)：43-44.

[8] 陈林姣，缪 颖，陈德海.原位PCR技术及其应用[J].生物工程进展,2000,20(2)：58-63.