人源细粒棘球蚴的RAPD分析体系建立

作者                作者单位

马学平   宁夏自治区疾病预防控制中心，宁夏 银川 750004

李丽     宁夏自治区疾病预防控制中心，宁夏 银川 750004

秦迎旭   宁夏自治区疾病预防控制中心，宁夏 银川 750004

高建炜   宁夏自治区疾病预防控制中心，宁夏 银川 750004

田涛     宁夏自治区疾病预防控制中心，宁夏 银川 750004

Establishment of RAPD technique system on larval Echinococcus granulosus from Patient

MA Xue-ping, LI Li, QIN Ying-xue, et al.(Ningxia Center for Disease Control and Prevention, Yinchuan 750004, China)

[Abstract] Objective To optimized an extraction condition of genomic DNA and established RAPD technique system on larval Echinococcus granulosus from Patient for improving the stability of random amplified polymorphic DNA (RAPD) genetic polymorphism.Methods The genomic DNA was extracted by using improvment phenol/chloroform method and established an optimal system of random amplified polymorphic DNA-PCR by using single factor screening method.Results The extracted genomic DNA was high quality, and it is suitable for PCR-RAPD analysis. The optimal PCR system for RAPD analysis was as follows: 0.2.-0.3mmol/L dNTP, 2.5U DNA template, 0.8μmol/L-1.4μmol/L random primer, 2μL genomic DNA. The optimal PCR procedure was as follows: Temperature cycle was designed in former denaturation at 95℃ 5min, 35 cycles with denaturation 94℃ 30 s anealing 32℃ for 45s and extension at 72℃ 60s, and last estension at 72℃ 10min, 11 random primers amplified bands and were screened out in 20.Conclusion Phenol/chloroform method is to apply to extract the genomic DNA and improve RAPD system and screen out random primer suitable for Genetic polymorphism of PCR-RAPD on larval Echinococcus granulosus from Patient.

[Key words] Larval Echinococcus granulosus from Patient; Genomic DNA extract; PCR-RAPD system

囊型棘球蚴病(Cystic echinococcosis,CE)是由细粒棘球绦虫(Echinococcosis granulosus，Eg)的幼虫引起的一种危害严重的人兽共患病寄生虫病，流行于我国西部地区的牧区和半农半牧区，在新疆、青海、甘肃、宁夏、西藏、内蒙古和四川西部最为严重[1]。

马兴忠在2001-2004年完成的全国人体重要寄生虫病现状调查结果表明，棘球蚴病流行区的12个省(区、市)人群的血清学阳性率高达12.04% [2]，流行现状严重，防治形势严峻。本实验对细粒棘球蚴的基因组随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)反应体系进行了优化,为提升细粒棘球蚴RAPD遗传多态性研究的稳定性和进一步研究细粒棘球蚴的分类学以及包虫病的分子流行病学奠定基础。

1 材料和方法

1.1 囊液收集和处理：人源细粒棘球蚴于2008年6月至2009年4月采自宁夏包虫病高流行区包虫病外科手术定点医院(海原、盐池、中宁县)，收集不同地区包虫病病人手术切除的包囊壁和包囊液，置于50ml塑料离心试管中，登记样本来源信息，保存于-80℃冰箱备用。

1.2 试剂和仪器：10个单条核苷酸引物由北京赛百盛生物有限公司合成，共20条。DNA提取试剂和PCR试剂均购自天根生化科技(北京)有限公司，基因扩增仪为中国杭州TC-25/H型，电泳仪为北京六一厂DDY—6C型，凝胶成像分析仪为BIO-RAD凝胶成像仪。

1.3 基因组DNA的提取与纯化：将采集的包囊液用PBS缓冲液漂洗3次，离心制成匀浆备用，同时将包囊组织块用液氮研磨后用PBS缓冲液漂洗3次，制成匀浆。取大约200μl左右上述处理样本，分别加入到1.5 ml Eppendorf离心管中，加入500μl 细胞裂解液(100mmol/L NaC1，l0mmol/L Tris-Cl，l mmol/L EDTA，0.5%SDS pH8.0)50℃温浴2h后，加入蛋白酶K(20g/L)和RNA酶(无DNase，10g/L)，37℃ 消化、裂解2h。按酚-氯仿抽提法[3]提取基因组DNA后，溶于80μl TE缓冲液中，用核酸蛋白测定仪检测浓度，保存于-20℃备用。

1.4 RAPD反应体系优化：选取DNA样品为模板进行RAPD扩增，RAPD反应体系总体积为25μl，在其它因子保持不变的情况下，按一定浓度梯度改变单一因子，筛选最优条件，以获得最优化、最稳定的反应体系。

1.5 RAPD 引物筛选：从20条引物中筛选可用于多态性分析的引物，20条引物序列见表1。

2 结果

2.1 DNA模板提取：DNA的提取和优化是进行RAPD扩增的首要条件，DNA质量的好坏直接影响着试验的成败。由于包囊壁组织和包囊液中含有大量的蛋白质、糖类等一些分泌物质的影响，因此，高表1 20条RAPD随机引物序列质量DNA的获得往往是进一步研究障碍，经过多次试验，对细胞裂解液、蛋白酶K和RNA酶的处理浓度和处理时间进行了优化，采用常规的酚-氯仿抽提的方法获得了用于PCR-RAPD试验的高质量模板DNA(图1，见目录后)。

2.2 RAPD反应体系优化

2.2.1 引物浓度：在25μl 体系中，加入浓度为10 mol/L引物的量为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μl，分别对应的引物浓度为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 pmol/L。如图2所示，不同引物量扩增的条带在亮度和数量都有变化，加入0.4-0.6 pmol/L量的引物扩增条带的数量和亮度没有加入0.8、1.0、1.2、1.4 pmol/L多和强，且随着引物浓度的增加，从0.8μmol/L开始扩增效果基本没有变化，扩增主带比较均匀，并没有形成引物二聚体。结果表明，在细粒棘球蚴RAPD反应体系中，加入引物量在0.8-1.4 pmol/L之间时比较合适(图2，见目录后)。

2.2.2 dNTP 浓度优化：在25μl 体系中，加入浓度为2.5mmol/L dNTP的量为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μl，分别对应的dNTP浓度为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 mmol/L。如图所示，当dNTP的加入量小于0.15 mmol/L时，部分扩增条带数量较少，亮度较弱，当dNTP的加入量0.2-0.3 mmol/L之间时，扩增条带清晰而且条带数较多，当dNTP加入量在0.35 mmol/L扩增产生的条带减少。结果表明，在细粒棘球蚴RAPD反应体系中，加入引物浓度在0.2-0.3 mmol/L之间比较合适(图3，见目录后)。

2.2.3 Tag酶浓度优化:Tag酶的加入量会对试验结果有一定的影响。在25μl 体系中，Tag酶(2.5 U/μl)的加入量分别为0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5μl，对应浓度为0.625、1.25、1.875、2.5、3.125、3.75 U。当Tag酶加入浓度为0.625、1.25、1.875 U时，扩增条带不明显，不能产生足够的扩增产物，当用量在2.5 U以上浓度时，扩增条带均较清晰。因此，加入2.5 U浓度的Tag酶已足够能扩增出特异性条带(图4，见目录后)。

2.2.4 模板浓度优化:在模板的加入量试验中，模板的加入量对试验的稳定性和重复性具有较大影响。当模板用量在30ng(1.0μl)时，不能够扩增出所有的特异性条带，且条带不清晰;当模板加入量在45-90ng(1.5-3.0μl)之间时，均能扩增出良好的带型，且60ng(2.0μl)用量效果最好;当模板用量为105ng时，加入了过量的模板分子，相当于引入了很多污染物，使扩增效果不理想，产生的重复性也较差。因此，在25μl体系反应体系中，模板按上述DNA提取方法，用量在60ng(2.0μl)时，效果最佳(图5，见目录后)。

2.2.5 PCR反应退火温度优化:随机引物退火温度分别设置为28、30、31、32、34℃。在28℃条件下，没有扩增条带;在30℃条件下，扩增条带数少且较弱;在31℃条件下，扩增条带数目有所增加，但各条带亮度较弱;在32℃条件下，扩增效果最佳，特异性条带清晰。34℃时，虽然条带清晰，但产生非特异型条带。因此，退火温度在32℃时，扩增效果最佳。

2.3 RAPD引物筛选:从20条引物中初步扩增带型较好的引物对细粒棘球蚴基因组DNA进行PCR扩增，经过电泳分析，SBS B06、SBS B08、SBS B09、SBS B10、SBS B11、SBS B12、SBS B15、SBS B16、SBS B18、SBS B19、SBS B20引物对模板扩增后，指纹图谱显示多态性较好，稳定性较强，可作为适宜引物进行RAPD分析。筛选出的这些RAPD引物适用于细粒棘球蚴的遗传多态性分析和分子流行病学调查等方面的研究。

3 讨论

RAPD技术是由Williams和Welsh等共同提出的一种分子标记技术，它以PCR技术为基础,用随机的短引物对基因组DNA进行扩增，这些引物可与基因组DNA模板序列最同源的任何部位结合，一系列随机引物的使用，可使几乎整个基因组差异都能显现出来[3]。在众多分子遗传标记技术中，RAPD技术具有操作简便、成本廉价等优点，并且能够区分种内变异物种，简捷的特点而广泛地应用于分子流行病学研究，是追查一些微小寄生虫的虫株和菌源的有效方法之一 [4-6]。由于RAPD在稳定性、重复性方面存在不足，对RAPD实验反应条件的优化，探索合适的扩增条件可弥补其稳定性方面的缺点。

RAPD实验的重复性和稳定性受诸多因素影响，但在RAPD反应体系优化后，实验仪器和试剂等不变的情况下，指纹条带图谱可受到有效控制[7]。在整个RAPD实验中，各主要因素对扩增的质量都会产生很大的影响，包括引物浓度、dNTP浓度、Tag酶浓度、模板的量以及PCR反应程序等重要因素。本实验在优化DNA模板浓度时也发现，DNA浓度在45-90ng之间波动时，对扩增结果影响不大，所用的随机引物浓度为0.8 pmol/L、Taq酶为2.5U、dNTP为0.2 mmol/L、退火温度为32℃时，扩增结果稳定、重复性好。在循环次数上，不同的研究者所采用的循环次数略有不同，多数采用45次循环[7]，本实验用循环次数35次得到的扩增结果更为理想，为省时起见，本研究采用最早提出的循环35次作为本研究的循环次数，并初步从20条随机引物中筛选出11条带型丰富的引物，适用于进一步对人源细粒棘球蚴的PCR-RAPD遗传多态性分析和分子流行病学进行研究。

【参考文献】

[1] 史大中.中国囊性包虫病的地理分布[J].地方病通报,2000,15(1):74-75.

[2] 许隆祺,陈颖丹,孙风华,等.全国人体重要寄生虫病现状调查报告[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2005,23(5):332-339.

[3] Williams JGK,Kubelik AR,Livak KL,et al.DNA polymerphisms amplifyde by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].J Nucl Acids Res,1990,18:6531-6535.

[4] 宋曼殳.绦虫基因组DNA随机扩增多态性研究[D]. 中国医科大学硕士学位论文,2002.

[5] 周晓辉,焦新安.产单核细胞李斯特菌的分子鉴定与亚分型研究[J].中国人兽共患病杂志,2003,19 (5 ):44-47.

[6] 崔百忠,金丽霞,李敏,等. 随机扩增多态性DNA(RAPD)技术用于青海田鼠鼠疫菌株亲缘性的研究[J].中国人兽共患病杂志,2003,19(1):58-59.

[7] 黄芳.随机扩增多态性DNA的研究[J].地方病通报,2000，15(1):79-80.