前B细胞克隆增强因子对急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征大鼠肺组织细胞豁附分子的影响
发表时间:2014-06-12 浏览次数:1778次
目前急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)是较常见的危重症,病因复杂,尽管现代医疗水平有了较大幅度的提高,但其仍有较高的患病率和病死率。而在ALI/ARDS的众多发病机制中,大量中性粒细胞等炎性细胞激活、迁移,在肺内的浸润和聚集被认为是ALI/ARDS的早期事件,这些炎性细胞可导致基底膜破坏和肺泡一毛细血管屏障通透性增加,同时炎性细胞分泌的促炎和促凋亡因子破坏了临近的组织细胞,而细胞间勃附分子一1(ICAM-1)、血管细胞薪附分子一1( VCAM-1)是在炎性细胞与血管内皮细胞薪附及其组织浸润中有重要作用的细胞因子。前B细胞克隆增强因子(PBEF)又称为内脂素(visfatin)或烟酞胺磷酸核糖转移酶( Nampt ),是近年来新发现的炎症因子,国外学者研究认为其可能是ALI/ARDS的潜在生物学指标}5,体外研究发现,PBEF可能涉及包括大量炎性细胞浸润在内的有关ALI/ARDS的多个病理生理过程本实验中通过观察PBEF对大鼠肺组织ICAM-1 ,VCAM-1表达的影响,探讨在ALI/ARDS发生时PBEF对中性粒细胞等炎性细胞激活及浸润的作用。
1材料与方法
1.1动物分组及模型复制:健康清洁级雄性SD大鼠40只,体质量200一230 g,购自重庆医科大学动物实验中心,动物合格证号:SCXK(渝)20070001。按随机数字表法将大鼠分为对照组、模型组、药物干预组、溶媒对照组4组,每组10只。以尾静脉注射油酸0.15 ml/kg复制ALI/ARDS模型,药物干预组和溶媒对照组分别在制模前24,12及0.5 h经腹腔注射PBEF抑制剂FK866 10 mg/kg或等体积FK866溶媒二甲亚矾。通过观察大鼠口唇颜色、毛发、呼吸频率及活动能力判断制模是否成功。
本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准。1.2检测指标及方法:在预实验中发现PBEF表达高峰约在制模6h左右,因此于制模成功6h后先分离气管,开胸结扎右肺门,气管切开、插管,行左肺肺泡灌洗术,收集支气管肺泡灌洗液(B ALF)后取材,以右肺上叶行病理学检查和免疫组化染色,右肺下叶行逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测
1.2.1酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF中炎症因子含量:按照肿瘤坏死因子一司TNF-cx入白细胞介素一1日(IL-1日)ELISA试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司)说明书进行操作。
1.2.2 RT-PCR法检测PBEF,ICAM-1, VCAM-1的mRNA表达:取100 mg左右肺组织加人液氮充分碾解细胞提取总RNA,逆转录至〔}DN A,引物由生工生物工程(上海)有限公司设计并合成PBEF:正义链5'-taaacaatacccacccaacaca-3',反义链5'-gtagttccatcccctttcattg-3',扩增产物大小241 bp; IC AM-1:正义链5'-aagggctgtcactgttcaaga-3',反义链5'-ggctgacacaaaatctctgct-3',扩增产物大小233 bp; VCAM-1:正义链5'-aaatgggaaggtgaagacagag-3',反义链5'-aaacatcaggagccaaacactt-3',扩增产物大小227 by;内参照p一肌动蛋白((3 -actin:正义链5'-cacccgcgagtacaaccttc-3',反义链5'-cccatacccaccatcacacc-3',扩增产物大小207 bp, PCR扩增后行凝胶电泳,用紫外凝胶分析系统定量,以目的基因灰度值/内参基因灰度值表示检测基因的相对表达量。
1.2.3免疫组化法检测PBEF , ICAM-1, VCAM-1的蛋白表达:各组织切片常规二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化后滴加3 % H202溶液15 min,用微波加热法修复抗原,自然冷却至室温后依次按说明书完成免疫组化染色各步骤,一二氨基联苯胺(DAB)显色,制片后采集图像,用Image-Pro Plus 6.0软件对PBEF,ICAM-1, VCAM-1的蛋白表达进行半定量分析,结果以平均吸光度(A)值表示。
1.3统计学分析:实验数据以均数士标准差(X士s)表示,采用SP}S 17.0软件分析,多样本均数间总体方差齐性检验采用LeVene检验。若总体具有方差齐性,多样本均数间进行ANOVA分析,两两比较采用}l检验;若方差不齐则采用秩和Kruskal-Wallis H检验。P< 0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1肺组织病理学观察:对照组大鼠肺组织肉眼观察呈粉红色,未见明显充血、出血及肿胀;光镜下观察肺组织结构完整、清晰,肺泡间质有较少炎性细胞浸润,无明显充血、出血,肺泡间隔无增宽,肺泡壁完整,腔内无水肿液(图la)。模型组大鼠肺组织肉眼观察呈暗红色、肿胀,可见明显出血、充血;光镜下可见肺组织出现大面积肺泡壁破坏,肺泡腔内充满粉红色水肿液,肺泡间隔增宽、水肿,大量炎性细胞浸润及红细胞漏出,肺血管充血(图1b)。药物干预组大鼠肺组织肉眼观察仍可见肿胀及充血出血,但程度较模型组轻;光镜下可见肺组织仍有与模型组相同的病理改变,但受损面积明显减小,肺泡腔内水肿液减少,肺泡间质水肿、炎性细胞浸润及红细胞漏出明显减轻(图1c)。溶媒对照组大鼠肺组织肉眼与光镜下观察结果与模型组类似(图1d)
2.2 BALF中TNF-。及IL-1日含量(表1):与对照组比较,模型组和溶媒对照组BALF中TNF-a,IL-1(3含量均明显升高(均P< 0.01);而药物干预组各指标均显著低于模型组和溶媒对照组,但仍高于对照组(P< 0.05或P< 0.01)。
2.3肺组织中PBEF,ICAM-1,VCAM-1的mRNA表达(图}9表2):与对照组比较,模型组和溶媒对照组PBEF,ICAM-1及VCAM-1 mRNA表达的灰度值比值明显升高(均P<0.01);而药物干预组各指标的灰度值比值均较模型组和溶媒对照组有所减小,但仍高于对照组(P< 0.05或P< 0.01) 。
2.4肺组织PBEF,ICAM-1,VCA-1的蛋自表达(表3):与对照组比较,模型组和溶媒对照组PBEF,ICAM-l ,VCAM-1蛋白表达显著增加(均P< 0.01) ;3讨论脓毒症、休克、创伤等是_4RDS的重要发病原因,白细胞过度经上皮移行和活化导致基底膜的破坏和肺泡一毛细血管屏障通透性的增加,以及小血_管内中性粒细胞聚集、黍占附,内皮细胞受损,肺毛细血管内形成微血栓是ALI/ARDs的主要病理生理过程,而大量炎性细胞特别是中性粒细胞在肺内浸润,进一步促进肺部炎症反应是ALI/AR DS发生早期的重要事件,而ICAM-1, VCA1}I-1则是与性细胞浸润有关的重要赫附分子。
ICAM-1 ,}%CAM-1是属于免疫球蛋日超家族中的两个重要分子,在介导细胞与细胞及细胞与细胞外基质之间的赫附中发挥重要作用因此在炎症反应调节、免疫应答反应的众多过程中均有ICAM-1,VC _4M-1的参与。IC AM-1的受体主要是淋巴细胞功能相关抗原一1( LFA-1),存在于中性粒细胞和除红细胞以外的造血细胞上;VCAM-1的受体主要是极迟抗原一4,存在于包括淋巴细胞、单核细胞等在内的单个核细胞上,但不存在于中性粒细胞中6因此It} AM- I主要介导中性粒细胞的豁附和迁移,而V% C AM-1主要介导单核细胞和淋巴细胞等的蒲附和迁移;ICAM-1还可能通过与中性粒细胞胞膜上的CDllb结合而介导其跨内皮移行〔工CAM-LVCAM-1主要表达在血管内皮细胞、肺泡上皮及支气管薪膜上皮细胞等,正常情况下不表达或者极少表达,而在ALI/ARDS发生时则大量表达。
PBEF是近年新发现的重要炎症因子,主要由脂肪细胞8和激活的炎性细胞{9〕分泌,全身多个器官均可表达,最初由国外学者发现,在ALI/ARDS患者血清和BALF中大量升高,故认为PBEF可能是ALI/APLDS的重要生物标志物。目前仅有体外细胞实验研究发现,炎症刺激可以使肺泡上皮细胞、肺微动脉内皮细胞等大量表达PBEF,而减少PBEF的表达则可减轻上述细胞由炎症刺激引起的相关损害,这些表明PB EF可能涉及包括肺微血管损伤”肺泡上皮细胞损伤、通透性增加,z-,“等在内的有关ALI/ARDS多个病理生理过程,但尚无体内实验直接观察到PBEF在ALI/_RDS中的致病作用。
在本实验中观察到,模型组大鼠肺组织出现大量炎性细胞浸润,肺组织充血、出血、水肿等典型的ALI/ABDS病理学表现,PBEF,ICAM-1,VCAM-1等的蛋自和mRI}A表达及TNF-a ,IL-1(3炎症因子含量也明显增多;用PBEF特异性抑制剂FK866于预后ALI/ARDS大鼠肺组织病理学改变减轻,炎症因子及PBEF',ICAM-l ,VCAM-1的mRIV A和蛋白表达有所减少,说明ALI/ARDS发生时PBEF大量表达的同时促进了ICAM-I ,VCAM-1的表达和炎症因子的产生,说明ALI/ARDS发生时PBEF在炎性细胞移行、浸润及其促炎反应的过程中具有重要作用在对人微静脉及脐静脉内皮的研究中发现,外源性PBEF刺激可增强单核/巨噬细胞等炎性细胞同内皮细胞翰附的能力.升高IC AM-1,VCAM-1表达.叮以汰为PBEF通过增加IC AM-1 ,VC AM-1等虱附分子的表达促进炎性细胞间内皮细胞的乳附,加重血管内皮的炎症反应和损伤11。其机制可能是PBEF通过增强TCAM-1 ,VCAM-1基因启动子中的核转录因子一KB ( NF-rcB)结合位点,特别是近端结合位点与NF-KB的结合活性可以刺激I(: A1T-七V-CAM-1的,nR1 A转录,用NF-KB抑制剂毗咯烷二琉基氨甲酸(PDTC)干预后可减少其转录;另一方面,若以活性氧(R0引清除剂N一乙酸基一L一半眺氨酸预处理后,给予同样的外源性PBEF刺激,N F-KB活性明显降低,ICAM-1 ,VCAM-1表达也相应减少因此,PBEF增强ICA M-1,VCAM-1表达的机制之一可能是通过ROS依赖的NF-KB活化途径。
综上所述,ALI/ARDS的发病机制涉及众多细胞因子和信号通路,而PBEF可能与ALI/-4RDS的病理生理过程相关。本实验发现,ALI/ARDS发生时PBEF能促进ICAM-1 ,VCAM-1的表达和炎症因子产生,可以认为PBEF在ALI/ARDS发生时对炎性细胞移行、浸润及其促炎反应具有重要作用。
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