高糖培养脂多糖刺激下肺脏微血管内皮细胞通透性改变及DDAH/NOS/NO失平衡在其发生机制中的作用

高血糖在严重感染患者中十分常见，并可以增加病死率。因此，高糖与内毒素作为损伤因子同时发生作用十分常见。内毒素脂多糖(LPS)可通过直接或间接方式损伤内皮细胞引起内皮细胞功能变化，如载附分子表达、细胞因子释放或屏障功能损伤，高糖也可以通过多种机制参与内皮细胞功能损害。但高糖如何影响LPS刺激下的血管内皮细胞损伤目前还不清楚。既往研究表明，高糖可以影响LPS引起全身炎症反应时机体的免疫反应状态，可使LPS刺激下的单核细胞株U937细胞CD14表达增加}一，基质金属蛋白酶(MMP)}'-、巨噬细胞炎症蛋白一1( MACP-1) }3}、肿瘤坏死因子一a(TNF-a尸产生增加，内皮细胞自细胞介素一8(IL-8)-s}、腹腔巨噬细胞活性氧(ROS ) }6〕表达增加。脓毒症时存在内皮细胞的活化和损伤，突出表现为微血管渗透性增加，进而加重器官功能障碍。一氧化氮(NO)是参与血管内皮细胞功能调节的重要介质，机体NO生成调节保持动态平衡对血管内皮细胞功能自稳平衡十分重要。NO调节失平衡是否参与高糖培养对LPS引起的血管内皮细胞损伤是本研究的目的。

1材料与方法

1.1仪器与试剂:肺脏微血管内皮细胞(PMVEC)购自上海拜力生物技术公司;DMEM细胞培养液、胰蛋自酶、新生小牛血清均购自美国Hyclone公司;大肠杆菌内毒素LPS(OSS:BS),D-葡萄糖粉均购自美国Sigma公司;诱生型一氧化氮合酶(i\TOS )、内皮型一氧化氮合酶(el\OS)、二甲基精氨酸一二甲胺水解酶2 (DDAH2)抗体均购自美国Santa Cruz公司;异硫氰酸荧光素丈 FITC)标记鬼笔环肤购自德国Anexin公司;X10试剂盒购自南京建成生物技术有限公司。

1.2 PMVEC分组及培养:将人PMV EC分为正常糖组(NG组)、正常糖十LPS刺激组(NGL组)、高糖组(HG组)、高糖+LPS刺激组(HGL组)4组分别培养。在人PMVEC中分别加人含10%小牛血清的高糖(33 mmol/L)或正常糖( 5.5 mmol/L )DMEM培养基，接种到培养瓶中，37 0C ,5% COZ孵箱培养，2d换液1次，培养Sd后加人LPS刺激细胞。

1.3四甲基偶氮哩盐(MTT)比色法测定细胞增殖及活性:将人PMVEC按(1一2 ) x 10'/L分别培养5 }l后，用0.01 ,0.1,1 ,10,100 mg/LLPS分别培养8,12,24,36 h，每孔加人0. 5 % MTT溶液20 },1继续培养4h终止培养，吸去孔内培养液，每孔加人150闪二甲基亚矾，置摇床上低速振荡10 min使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪波长490 nm处测量各孔的吸光度(A)值。同时设置调零孔(培养基、M'I'T、二甲基亚矾)和对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚矾)以绘制细胞生长增殖曲线，选出对细胞活性影响最大的刺激时间及浓度进行下一步实验。

1.4纤维肌动蛋白(F-actin)特异性荧光染色:将人PIE-M-E C以(I一2 ) x 10'几接种于微孔小皿中，培养2一3d，待细胞融合后改用无血清培养基继续培养24 h，使细胞同步生长并处于静止期。根据实验设计和步骤刺激细胞后，用冷磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2minx3次，4%多聚甲醛孵育IO min;再用冷PBS漂洗2minx3次，0.5%曲通一100孵育5 min ;最后冷PBS漂洗2minx3次。用5 kU/L FITC标记的鬼笔环肤染色，荧光显微镜下观察照相采图。

1.5细胞膜改变:将4组细胞分别爬片接种于载玻片上经过戊二醛固定一PBS漂洗一饿酸浸泡一PBS漂洗一叔丁醇梯度脱水一冷冻干燥等过程后，金属金离子镀膜，扫描电镜下观察。

1.6建立微血管内皮细胞屏障并测定单层细胞对辣根过氧化物酶(HRP)的通透性:采用细胞迁移实验，将4组细胞接种至Transwel.l板中，上层加人100闪培养液，下层加人600闪培养液，测定跨内皮细胞电阻(TEER )，当TEER升高大于100 iZ " cmz细胞铺满单层，进行后续实验。

4组细胞分别刺激及培养形成单层，上池加人HRP, 37℃孵育1h后收集基底池液体，测定HRP通透率(基底池HRP浓度/最初加人的HRP浓度x 100%)

1.7蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测各

组内皮细胞DDAH2,iNOS,eNOS蛋白表达:提取蛋白，用Folin-酚试剂法进行蛋白定量。以每孔80 },g上样，加人12%十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转印至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉吐温20-Tris ( T-TBS)缓冲液封闭膜封闭，依次加人一抗(1:400)、二抗(HRP标记羊抗兔IgG ,1:400)室温下孵育，T-TBS洗3次，碱性磷酸酶显色15 } 30 min, GDS 800凝胶自动成像仪扫描成像，V 2.03分析软件测定积分A值。

1.8   NO测定:采用硝酸盐还原法(Cries、法)测定NO，操作按试剂盒说明书的要求和步骤进行。

1.9统计学分析:采用SPSS 14.0统计软件处理，实验数据以均数士标准差(x土、)表示，各组间比较用单因素方差分析，随后采用LSD法进行两两比较，P< 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1  LPS刺激的最佳浓度和时间选择:细胞增殖曲线的浓度效应图显示，低浓度LPS刺激细胞活性，高浓度LPS抑制细胞活性，10 m郭L时有明显的抑制作用;时间效应图显不，早期有轻度刺激细胞活性，24 h后显示出细胞活性受到明显的抑制因此选取10 mg/L LPS进行24 h培养。

2.2各组细胞中F-actin表达(图1):NG组F-actin在细胞内分布均匀一致;HG组F-actin在细胞内轻度聚集;NGL组LPS刺激后细胞间隙增大，F-actin纤维集束明显、部分断裂;HGL组LPS刺激后细胞间隙增大明显，F-actin纤维集束、断裂明显。

2.3扫描电镜细胞膜窗孔情况(图2):NG组细胞膜未见窗孔形成;HC组细胞可见窗孔，细胞膜表面粗糙;NGL组LPS刺激后细胞窗孔直径增大明显数目增多，部分融合形成较大漏孔;HGL组IPs刺激后细胞间隙增大明显，窗孔进一步增多且直径增大明显，融合形成较大漏孔弥漫分布。

2.4单层细胞HRP通透率(表1):单纯高糖培养可能加重单层细胞对HRP的通透率(P< 0.01) ; LPS刺激正常糖及高糖细胞均可使通透率增加，后者较前者更明显(均P< 0.01)

2.5细胞上清液中NO含量(表}>:Hc组细胞上清液中NO含量较Nc组明显增加(P< 0.05 ) ; LPS刺激正常糖组及高糖组均可使细胞上清液中NO含量增加后者增高程度高于前者(均P< 0.01)。

2.6细胞DD}H2,iVOS,eVOS蛋自表达(图3一4):单纯LPS及高糖刺激均可使DDAH2的表达减少(P< 0.01和P< 0.05 );高糖培养后，LPS刺激可使DDH }2表达更为减少(均P< 0.01)。二者单纯刺激均可使iNOS表达增加，共同刺激可使iNOS表达进一步增加(均P< 0.01)二者单纯刺激均可使eNOS的表达减少，共同刺激可使eN O S表达更为减少(P< 0.05或P< 0.01)。

3讨论

一般认为，急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征( ALI/ARDS)发生的病理生理基础为内皮细胞活化和损伤，突出表现为微血管通透性增加。影响微血管内皮细胞通透性增加有3种方式，即细胞间的紧密连接;内皮异常增加改变的细胞窗孔;有特殊受体介导的转运机制!7)。对于细胞间紧密连接机制，普遍认为与内皮细胞的F-actin重排有关’Hi。细菌内毒素及炎症介质等可通过信号转导或直接作用于肌动蛋白，通过肌动蛋白的解聚和聚合的转换导致肌动蛋白纤维的断裂及其再分布，F-actin的重组与细胞旁通路的开放之间存在着结构和功能关系’9-12]。对于有特殊受体介导的转运机制，炎症因子与其受体结合后能激发细胞内多个信号转导的级联反应，最终引起内皮细胞收缩和细胞间乳附作用减弱，从而导致内皮细胞通透性增加一’3本研究中通过F1TC标记的鬼笔环肤特异性免疫荧光染色及扫描电镜下直观地反映出，将PMVEC在LPS刺激下的高糖环境中培养，F-ac}ti。在内皮细胞内重排较正常糖培养更加明显，发生应力纤维形成、集束现象。

内皮细胞窗孔在正常情况下仅允许水及小分于物质通过，而在毒素等刺激下可以出现窗孔数目及直径增加，从而可以通过大分子物质使通透性增加;细胞膜窗孔直径增大，相邻间出现融合数目增多。LPS刺激下高糖培养可使细胞膜窗孔融合明显，数量进一步增多。HRP是测定血管内皮通透性的代表性大分子物质，本研究显示，高糖培养会使LPS引起的内皮细胞单层对HRP通透性增加近2.3倍。以上研究表明高糖加重了内毒素引起的内皮细胞通透h增加的损害作用，但对于发生机制目前不明。

NO是参与血管功能的重要介质。以往研究证明，在危重症患者中内皮细胞产生的NO参与其发病机制及器官功能损害作用〔川。神经型一氧化氮合酶(nNOS)和iNOS在生理情况下恒定少量表达，作为信号分子、神经递质调节线粒体功能及宿主防御反应，维持血管稳态，包括减少自细胞勃附、抑制血小板激活、使平滑肌舒张、保持薪膜严密性。而在免疫激活时iNOS大量表达，一方面通过与线粒体作用使能量产生减少、ROS产生增多;另一方面使血管通透性增加〔15一16。本研究发现，在LpS刺激下细胞eNOS表达减少，33 mmol/L的高糖可以使eNOS表达较正常糖更为减少。eNOS活性受非对称性二甲基精氨酸(ADMA)内源性NOS抑制剂的抑制，DDAH2是其水解酶，也是决定ADMA含量的关键酶。高糖培养的内皮细胞在LPS刺激下DDAH2含量减低，因此eNOS表达减少。已有研究证实，DDAH/ADMA通过Rae 1信号通路调节肺脏内皮细胞屏障的紧密连接rm，具体机制可能为:① ADMA使eNOS脱藕联，一方面使eNOS产生的NO减少，另一方面使ROS氧自由基及氮自由基(RN引产生增多，其产物硝硫睛酷参与肺脏损害的发生。

本研究显示，LPS刺激内皮细胞上清液中反映NO水平的亚硝酸盐含量升高，iNOS表达升高;高糖培养可加重这一变化。高表达iNOS产生的NO参与血管内皮细胞功能不全zo，表现为三方面:① iNOS与eNOS竞争四氢生物喋吟(BH4)一氧化氮合成的底物。.iNOS可引起硝硫氰醋升高，使DD AH2活性降低，因此，ADMA水平升高对eN OS产生抑制二③iNOS与高尔基体的距离较eN OS更近，故i10S效率高。研究证实，ADMA对NOS抑制的效率存在差别，eNOS在数秒至数分钟内即可发生皮克到纳克水平的变化，而iNOS则需在数小时至数天内仅发生纳克到毫克水平的变化，可见ADMA对NOS的抑制效率eNOS高于iNOS}z'v，因此，总体表现为LPS刺激下iNOS表达及NO水平升高，eNOS及DDAH2表达减少;高糖培养可加重该变化。

    综上所述，高糖可使LPS刺激下微血管内皮细胞F-actin重排及细胞单层窗孔增大，对大分子物质通透性增加，NO在精细调节系统作用下保持动态平衡〔'}}; LPS等可引起该调节系统变化，进而使机体NO在不同时相、各系统器官细胞分布部位表达变化;高糖对LPS引起的该系统失衡损害加重，内皮细胞功能损害更为严重，表现为细胞骨架肌动蛋白重排，使细胞间连接结构破坏，以及细胞窗孔直径及数量的异常增加，最终表现为微血管内皮细胞单层通透性增加，参与急性炎症反应条件下高血糖损害的发生。对NO系统进行调节干预有可能减轻该损害的发生。

参考文献

[1]Nareika A,  lm YB,  Game BA,  et al.  High glucose enhances lipopolysaccharide-stimulated   CD14    expression   in   L'937 mononuclear cells by increasing nm:lear factor kappaB and AP-1 activities. J L'ndocrinol, 2008, 196:45-55.

[2]Maldonado A, He L, Game BA, et al. Pre-exposure to high glucose augments lipopolysaccharide-stimulated matrix metalloproteinase-1expression by human U937 histiocytes. J Periodontal Res,2004, 39:415-423.

[3]areika A,  Maldonado A,  He I，et al.  High glucose-boosted  inflammatory responses to lipopolysaccharide are suppressed  by    statin. J Periodontal Res,2007,42:31-38.

[4]Sherry  CL，0'Gonnor  JG,  Kramer  JM,  et  al.  Augmented Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha production by peritoneal macrophages in  Lype 2 diabetic mice  is dependent on elevated glucose and requires p38 MAPK. J Tmmunol, 2007,178:663-670.

[5]Nods A,  Kinoshita  K,  Sakurai A,  et al.  Hyperglycemia and Lipopolysaccharide  decrease  depression  effect  of  interleukin 8 production by hypothermia: an experimental study with endothelial cells. Intensive Gare Med,2008,34:109-115.

[6]de Souza T,F, Barreto F,  da Silva EG,  et al. Regulation of LPS  stimulated  ROS  production  in  peritoneal  macrophages  from  alloxan-induced diabetic rats:  involvement of high glucose and PP ARgamma. Life Sci , 2007 , 81:153-1_59.

[7]Vu  DM,Yokoyama  TA,  Sawada  K,  et  al.  Enhancement  of  permeability  in  endothelial  cells  for  the  development of an antithrombogenic  bioartificial  hemofilter.   Biotechnol  Bioeng, 2008,101:634-641.

[8]毛怡然，肇冬梅，马晓春.肝素对脂多糖诱导内皮细胞通透性增高的保护作用.中国危重病急救医学,2012,24:278-282.

[9] Hirase T,   Staddon J94,  Saitou M,  et al. Occludin as a possible  determinant  of  tight junction permeability in  endothelial  cells. J (:ell Sci. 1997,110:1603-1613.

[10]dismal transduction pathways in enhanced microvascular permeability . '1licrocircul anon, 2000 , 7 ; 395-403.

[11]Ivecil((} . Oshima T, Alexander JS. The role of p38 MAP kinase in hydrogen   peroxide   mediated   endothelial  solute   permeal;lity.  Endothelium , 2001, 8 :107-116.

[12]郑运江，汤耀卿，刘伟，等.肿瘤坏死因子一a对血管内皮细胞通透性及细胞骨架和紧密连接形态变化的诱导作用.中国危重病急救医学,2009,21:160-163.

[13]章志丹马晓春脓毒症血管内皮细胞损伤与微循环功能障碍. 中国危重病急救医学2011.23:125-128.

[14]Bojun ga J.   Dresar-}Tacert B.Lsadel KH,  et a1. Antioxidative treatment  reverse;  imbalance,   of  nitric  oxide  svnthase  isofonn expression and attenuates tissue-cG11P actisation in diabetic rata. Biochem Bioph ss Res Common, 2004.316: 771-780.

[15]1'ober JS.  Seasa WC. Evolving fttnetions of endothelial cells in inflammation. Sat Rev Immu not, 2007 , 7 ; 803-815.

[16]Baumgarten G.  Knuefermann P. Schuhmacher G,et al. Toll-like receptor 4, nitric oxide, and myocardial depression in endotoxemia. Shock, 2006.25:43-49.

[17]Wojciali-Stothard B,  Torondel B‘7.hao L,  et al. Modulation of Racl activity by ADMA/DD· 1H regulates pulmonary endothelial barrier function. Mol Biol Gell .2009 , 20: 33-42.

[18]Sud N, Wells SM, Sharma S, et al. Asymmetric dimethvlarginine  inhibits HSP90 activity in pttlmonat}- arterial endothelial cells: rolef mitochondrial dysfunction. Am  J  Physiol Gell Phvsio1,2008, 294: C1407-1418

[19]Sharma S,  Stnith A, Kumar S,et al. Mechanisms of nitric oxide aynthase uncoupling in endotoxin-induced acute lung injury; role of asymmetric  dimethvlarginine.  }'ascul Pharmacol，2010, 52:182-190.

[20] Shelkovnikov  S,Gonick  HC.  Peroxynitrite  but not   nitric  oxide  donors destroys epinephrine:  HPLC measurement and rat anrta contractility. Life Sci.2004,75:2765-2773.

[21]Ulker S,  Cinar MG,  Can C,  et al. Lndotoxin-induced vascular  hyporesponsiveness in rat aorta: in vitro effect of amiuogrranidine. Pharmacol Res, 2001, 44: 22-27.

[22]Wang QH, Liu YJ, Liu J, et al. Plasmodium voelii:assessment of  production  and  role  of  nihic oxide during the early  stages  of  infection  in  susceptible  and  resistant   mice.  Exp   Parasitol,  2009,121:268-273.