胚胎干细胞来源造血细胞的细胞表型和功能分析

作者         作者单位

陈晓勤  中山大学肿瘤防治中心 广东 广州 510060

那晓东　中山大学中山医学院病理生理学教研室  广东　广州 510080

余伟华  广东省人民医院， 广东 广州 510080

李树浓  广东省人民医院， 广东 广州 510080

张秀明  广东省人民医院， 广东 广州 510080

曾有健  广东省人民医院， 广东 广州 510080

林承光  广东省人民医院， 广东 广州 510080

郑芹    广东省人民医院， 广东 广州 510080

蒋涛    广东省人民医院， 广东 广州 510080

Phenotypic and Functional Analysis of Embryonic Stem Cell Derived Hematopoietic Cells

CHEN Xiao-qin1， NA Xiao-dong2*， YU Wei-hua2， LI Shu-nong2， ZHANG Xiu-ming2， ZEN You-jian1，

LIN Cheng-guang1， ZHENG Qin2， JIANG Tao3

(1. Cancer Center， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510630， China; 2. Department of Pathophysiology， Zhongshan School of Medicine， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510080， China; 3. Guangdong General Hospital， Guangzhou 510080， China)

Abstract： 【Objective】 To establish an effective and stable method to induce hematopoietic cells from embryonic stem(ES) cells， the phenotype and function of ES-derived hematopoietic cells induced by stromal cell conditioned medium (SCCM) of yolk sac (YS)， fetal liver (FL) or bone marrow (BM) were analyzed and compared. 【Methods】 10% of YS-SCCM， FL-SCCM or BM-SCCM was added to culture system for differentiation of ES cells. Flow cytometric analysis was used to identify expression of Flk1， Integrin α4， Sca-1， and CD34. Colony analysis was used to identify the quantity of high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFC) in differentiated ES cells. The yield of CFU-S (colony-forming unit-spleen) was also analyzed by transplanting ES cell derivatives into lethally irradiated mice. 【Results】 Expression of Flk1， Integrin α4， Sca-1， and CD34 could be tested on induced EB cells. The percentage of Flk-1+， Integrin α4+ and Sca-1+ cells induced by were 3.03%， 2.9%， and 13.74%， respectively， which are greater than other groups. The percentage of CD34+ cells induced by BMSC-CM was 1.07% which was greater than other groups. The yields of HPP-CFC from hematopoietic cells induced by FLSC-CM or BMSC-CM were 7.4 /105 cells (P < 0.01) and 5.8 /105 cells (P < 0.05) which were greater than the yields of control group. The yields of CFU-S from hematopoietic cells induced by FLSC-CM or BMSC-CM were 8.5/5 × 105 cells and 6.75/5 × 105 cells which were also greater than the yields of control group (P < 0.001). 【Conclusion】 Both YS-SCCM， FL-SCCM， and BM-SCCM could promote hematopoietic differentiation of ESE14.1 cells. Hematopoietic differentiation induced by FL-SCCM or BM-SCCM is more effective， which generates hematopoietic progenitor cells with normal function. Application of FL-SCCM generates more primitive hematopoietic progenitor cells than that of BM-SCCM.

Key words： embryo; development; hematopoiesis; differentiation

[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2009，30(4)：367-371]

胚胎干细胞(embryonic stem cell， ES cell)细胞是维持未分化状态和保持全能分化能力的最原始干细胞。ES细胞在无分化抑制因子的培养体系中或体内表现出全能分化特性，在自然状态下，ES细胞的自发分化是随机的和不同步的。由于细胞成份的不确定性及可能存在未分化细胞，自发分化的ES细胞不适于作为细胞治疗的细胞来源[1]。通过提供定向分化的诱导环境可提高ES细胞向特定细胞类型分化的效率，研究表明应用造血生长因子、各种来源的基质细胞层及其条件培养液均可促进ES细胞向造血细胞的分化[2-4]。本研究应用卵黄囊、胎肝和骨髓基质细胞条件培养液(stromal cell conditioned medium， SCCM)促进ESE 14.1细胞向造血细胞的定向分化，并对不同诱导方法产生的ES来源造血细胞进行细胞表型和功能分析，以期稳定和优化ES细胞向造血细胞定向分化的培养体系，并对ES来源造血细胞的进行综合评价。

1 材料和方法

1.1 材 料

6 ～ 8周龄SCID小鼠、昆明小鼠，昆明孕鼠(交配后9 ～ 11 d)，SPF级，由中山大学中山医学院实验动物中心提供。

1.2 试 剂

高糖DMEM培养基、进口胎牛血清、牛血清白蛋白(BSA)、非必需氨基酸、β-巯基乙醇、L-谷氨酰胺购自Gibco BRL，rmSCF、rmEPO、rmIl-3、rmIl-6，rmGM-CSF均为Pepro Tech 公司产品，小鼠白血病抑制因子(murine leukemia inhibitory factor， mLIF)购自CHEMICON，甲基纤维素、琼脂为Sigma公司产品，马血清购自中国军事医学科学院，FITC-rat anti mouse Sca-1、PE-rat anti mouse CD34、FITC-/PE-rat IgG2a购自BD Biosciences Pharmingen。

1.3 方 法

1.3.1 三种来源基质细胞条件培养液的制备　颈椎脱臼处死孕鼠(交配后9 ～ 11 d)，体积分数75%乙醇消毒，剪开子宫，取出全部胚胎，从第9天的胚胎中分离卵黄囊，从第10 ～ 11天的胚胎中分离胎肝，用0.25 g/L胰蛋白酶消化，离心，分别收集卵黄囊和胎肝细胞。用含10 mol/L FBS的DMEM培养液重悬细胞。取成年小鼠双侧股骨，用含10 mol/L FBS的DMEM培养液反复冲洗骨髓腔，制备骨髓单细胞悬液。在37 ℃、体积分数5% CO2及饱和湿度环境中分别培养卵黄囊、胎肝和骨髓基质细胞，待细胞生长汇合至亚融合状态(80%)，更换为无血清DMEM，培养48 h，离心收集上清，经0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，分装于 -20 ℃保存。

1.3.2 ES细胞的造血分化培养 传代培养的ESE14.1细胞经消化脱壁后，取细胞微团接种于造血分化培养体系(含8 g/L甲基纤维素、15 mol/L FBS、450 μmol/L硫代甘油)。实验组分别加入体积分数10%卵黄囊基质细胞条件培养液(YS-SCCM)、胎肝基质细胞条件培养液(FL-SCCM)或骨髓基质细胞条件培养液(BM-SCCM)，对照组不加条件培养液，置于Petri dish中悬浮培养，隔日换液。培养7 d 后将胚胎体消化为单细胞悬液，进行表面标志检测及造血集落分析。

1.3.3 分化ES细胞表面标志的检测 取诱导分化后的ESE14.1细胞，消化、离心后重悬细胞，调整浓度为1 × 106 cells /mL。在制备好的细胞悬液中分别加入以下荧光素标记抗体：Fluorescein isothiocyanate (FITC)-rat anti mouse Sca-1， Phyco-erythrin (PE)-rat anti mouse Flk-1、 Integrinα4 (CD49d)和CD34，FITC-/PE-rat IgG2a，4 ℃孵育30 min，用含体积分数0.1% BSA的PBS洗涤、重悬细胞，移入专用测试管，应用流式细胞仪(FACSVantage)检测，联机专用软件Cell Quest分析。

1.3.4　分化ES细胞的高增殖潜能集落形成细胞(HPP-CFC)分析　取分化诱导后的ES细胞进行HPP-CFC的集落培养。HPP-CFC培养体系为：DMEM培养液含体积分数30%马血清、3 g/mL琼脂、单个核细胞浓度2 × 105/mL、rmGM-CSF 50 U/mL、rmSCF 50 ng/mL、rmIL-3 50 U/mL和rmIL-6 75 ng/mL;每培养体系0.5 mL，每组种3孔，用24孔板培养，置33 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度下培养14 d。倒置显微镜下观察HPP-CFC集落直径大于1.0 mm，细胞数大于 50 000个，集落松散均匀，但有一个致密的集落中心，细胞形态学检查，集落主要由粒细胞和单核细胞组成，计数HPP-CFC集落数。

1.3.5 分化ES细胞中CFU-S12的检测 取5 d 前开始饮用含庆大霉素(32 × 104 U/L) 和红霉素(250 mg/L) 水的SPF级C57小鼠，经60Co 全身照射(TBI)(9. 0 Gy，剂量率为0. 5 Gy/min)后，经尾静脉注射移植诱导分化的细胞(5 × 105/只)。在层流柜中无菌饲养。移植细胞后第12天取出脾脏，固定后计数脾脏表面的脾结节数目。

1.3.6　统计学分析　实验数据为5 次以上结果，以x ± s表示， Excel软件作图，各组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验。

2 结 果

2.1 三种来源基质细胞条件培养液造血活性的检测

取原代培养的卵黄囊、胎肝和骨髓基质细胞，制备无血清条件培养液层。在分化诱导培养体系中分别加入3种来源基质细胞条件培养液，观察不同浓度条件培养液(体积分数5% ～ 30%)对造血祖细胞CFU-GM和HPP-CFC产率的剂量反应关系，结果表明：浓度为体积分数10% ～ 15%的3种来源基质细胞条件培养液均适于造血细胞的体外生长。本研究在分化诱导培养体系中使用体积分数10%的基质细胞条件培养液。

2.2 分化ESE14.1细胞造血发育相关表面标志的检测

取各组诱导分化7 d的ESE14.1细胞进行造血发育相关表面标志的检测(图1)，FCM结果表明：各组EB细胞均可检测到造血发育相关表面标志Flk-1、Integrin α4、Sca-1和CD34的表达，对照组EB细胞中原始造血细胞比例最低，CD34+ 细胞为0.26%;经FL-SCCM诱导的EB细胞Flk-1+、Integrin α4+ 和Sca-1+ 细胞均高于YS-SCCM和BMSC-CM诱导组，分别为3.03%、2.9%和13.74%;经BMSC-CM诱导的EB细胞中CD34+ 细胞比例最高，为1.07% (图2)。

2.3 分化ESE14.1细胞的高增殖潜能集落形成细胞(HPP-CFC)分析

取各组诱导分化7 d的ESE14.1细胞进行HPP-CFC培养，HPP-CFC计数结果见图3，对照组EB细胞中HPP-CFC最少，为2.6个/105细胞;经FL-SCCM和BMSC-CM诱导的EB细胞HPP-CFC数量较对照组明显增多，分别为7.4个/105细胞(P < 0.01)和5.8个/105细胞(P < 0.05)。

2.4 分化ESE14.1细胞中CFU-S的检测

将各组诱导分化7 d的ESE14.1细胞经尾静脉注射移植给经致死剂量照射的小鼠体内，移植后第12天，取出脾脏，肉眼可见脾脏表面有因造血灶细胞增生形成的结节，即CFU-S。各组CFU-S计数结果见图4，未移植细胞的照射对照组小鼠脾脏无CFU-S形成，对照组及经YSSC-CM诱导组EB细胞中CFU-S最少，不到1个/5 × 105细胞;经FLSC-CM、BMSC-CM诱导的EB细胞中CFU-S较多，分别为8.5个/5 × 105细胞和6.75个/5 × 105细胞(P < 0.001)。

3 讨 论

在胚胎造血发育研究中，ES细胞主要的科研优势在于为胚胎发育研究提供了易于获取的细胞材料。从临床应用角度考虑，ES细胞来源的造血干细胞与传统来源如骨髓、脐血的造血干细胞相比有许多优势。合适的供体骨髓来源困难;脐血虽已建库，但脐血中的造血干细胞数目极为有限，不适于用于成人治疗，目前尚无有效方法将这些来源的造血干细胞有效扩增并保持其长期重建造血功能。与此相反，ES细胞可在体外无限扩增，而且将来极可能通过体细胞的重新程序化获取与患者表型一致的ES细胞，借助于定向分化诱导技术将有望生产足够数量的细胞用于造血干细胞移植治疗。

ES细胞生成血细胞的能力最初为Doetschman等关注[5]。他们将ES细胞通过悬浮培养诱导分化形成胚胎体，其中许多胚体发育为含血红蛋白的血岛。目前已有较多文献报导ES细胞可在体外诱导分化为造血细胞，但目前ES细胞分化为造血细胞的比例较低，并且产生的造血细胞迅速向成熟血细胞分化。如能在体外模拟造血发育微环境，将有利于提高ES细胞向造血细胞的分化效率，并使生成的造血干细胞通过体外培养得到有效扩增。

基质细胞是构成血发育微环境的主要功能成份，造血基质细胞层及其条件培养液中含多种刺激造血的功能成份，可在体外较好模拟胚胎造血发育环境。在胚胎造血发育过程中伴随着造血位点的迁移，卵黄囊是哺乳动物胚胎发育的第一个造血中心，卵黄囊的基质细胞在启动胚胎造血发育中发挥了重要的作用[6-7]。当卵黄囊的造血干细胞迁移到肝脏后进一步发育，获得成年造血重建能力[8-9]。在肝脏中发育完善的造血干细胞定居到骨髓，骨髓成为延续终生的造血部位。本研究将源自不同发育阶段的基质细胞条件培养液加入分化体系，以期为ES细胞提供一个支持造血发育的环境。造血干细胞发育的早期存在FLK-1、Integrin-α4、Sca-1及CD34等表面标志的顺序表达[10-11]，我们在实验中采用FLK-1、Integrin-α4、Sca-1和CD34比较不同分化体系中ES细胞向造血细胞分化的效率并对分化产生造血细胞的原始程度进行评价。结果表明：与自发分化的对照组相比，3种来源的基质细胞条件培养液均可支持ES细胞向造血细胞分化，FLSC-CM诱导形成的造血细胞表达FLK-1、Integrin-α4和Sca-1的比例均高于YSSC-CM和FLSC-CM诱导形成的造血细胞，提示FLSC-CM能有效促进ES细胞向造血细胞分化，经FLSC-CM诱导的EB细胞中Sca-1+ 细胞比例最高，提示所产生的造血细胞维持在较原始的造血干细胞阶段;经BMSC-CM诱导的EB细胞中CD34+ 细胞比例最高，而Sca-1的表达水平明显低于YSSC-CM和FLSC-CM诱导形成的造血细胞，提示经BMSC-CM诱导产生的造血细胞可能存在过度分化。

ES在分化为造血细胞的过程中，不仅表达造血细胞表面标志，同时也获得了造血功能。与红系祖细胞和粒巨噬系祖细胞等定向祖细胞相比，CFU-S和HPP-CFC为更为原始的髓系造血祖细胞[12]，具有一定的自我更新能力，能进一步分化为各系造血祖细胞并发育为多种类型的血细胞， CFU-S和HPP-CFC的产率既可以反映ES来源造血细胞的原始程度，也可以反映ES来源造血细胞的功能状况，经FLSC-CM诱导的EB细胞中CFU-S和HPP-CFC集落产率最高，这与细胞表面标志的检测结果是一致的;经YS-SCCM诱导的EB细胞中HPP-CFC集落产率最低，提示经YS-SCCM诱导产生的造血细胞功能发育尚不完善。ES来源造血细胞的功能分析结果提示：在3种基质细胞条件培养液中，FLSC-CM诱导ES向造血细胞定向分化的效果最佳。

应用来源于胚胎干细胞的细胞进行移植治疗时，首先必须保证植入的细胞必需具有正常机能;同时，应排除移植细胞可能存在未分化的胚胎干细胞。本研究将不同方法诱导分化的ES细胞注射到SCID小鼠体内观察分化细胞的致瘤性，结果发现经3种基质细胞条件培养诱导发育形成的胚胎体细胞注射至SCID小鼠体内均未形成瘤体组织，以上结果提示经定向诱导发育产生的造血细胞有望成为造血干细胞移植的理想细胞来源。

【参考文献】

1 Srivastava AS， Malhotra R， Esmaeli-Azad B， et al. Prospects of embryonic stem cells in treatment of hematopoietic disorders[J]. Curr Pharm Biotechnol， 2007，8(5)：305-317.

2 Tian X， Morris JK， Linehan JL， et al. Cytokine requirements differ for stroma and embryoid body-mediated hematopoiesis from human embryonic stem cells [J]. Exp Hematol， 2004，32(10)：1000-1009.

3 Vodyanik MA， Bork JA， Thomson JA， et al. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells： efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential[J]. Blood， 2005，105(2)：617-626.

4 Kaufman DS， Hanson ET， Lewis RL， et al. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2001，98(19)：10716-10721.

5 Doetschman TC， Eistetter H， Katz M， et al. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines： formation of visceral yolk sac， blood islands and myocardium [J]. J Embryol Exp Morphol， 1985， 87(1)：27-45.

6 Na XD， Wang QR. The effects and mechanism of YSEC-CM on the growth of yolk sac hematopoietic stem/ progenitor cells [J]. Leuk Res， 2004，28(11)： 1189-1195.

7 那晓东，王绮如，赵自平. 小鼠卵黄囊内皮细胞的体外培养及其细胞因子表达的检测 [J]. 中国病理生理杂志，2003，19(12)：1603-1606.

8 Dang SM， Kyba M， Perlingeiro R， et al. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems[J]. Biotechnol Bioeng， 2002，78(4)：442-453.

9 Charbord P， Oostendorp R， Pang W， et al. Comparative study of stromal cell lines derived from embryonic， fetal， and postnatal mouse blood-forming tissues [J]. Exp Hematol， 2002，30(10)：1202-1210.

10 Shinoda G， Umeda K， Heike T， et al. alpha4-Integrin(+) endothelium derived from primate embryonic stem cells generates primitive and definitive hematopoietic cells [J]. Blood， 2007，109(6)：2406-2415.

11 Yao H， Liu B， Wang X， et al. Identification of high proliferative potential precursors with hemangioblastic activity in the mouse aorta-gonad- mesonephros region [J]. Stem Cells， 2007，25(6)：1423-1430.

12 Yang G， Hisha H， Cui Y， et al. A new assay method for late CFU-S formation and long-term reconstituting activity using a small number of pluripotent hemopoietic stem cells [J]. Stem Cells， 2002，20(3)：241-248.