单细胞多重巢式PCR在多囊肾病中胚胎植入前诊断的实验研究

作者             作者单位

朱琴      温州医学院附属第一医院 325000

徐炳森    温州医学院附属第一医院 325000

黄学锋    温州医学院附属第一医院 325000

周颖      温州医学院附属第一医院 325000

【摘要】

【关键词】

【Abstract】 Objective To establish the technology of multiple nest fluorescence single cell PCR, for preimplantation genetic diagnosis for autosomal dominant polycystic kidney disease. Method Use quadruplex nested fluorescent PCR and capillary electrophoresis to analysis the polymorphism type of KG8, SM6, CW4 and CW2 of single lymphocytes. Result The amplification success rate of KG8, SM6, CW4 and CW2 are 85.93%, 89.06%, 92.18% and 89.06%, respectively, and the ADO of KG8, CW4 and CW2 are 25.64%, 25% and 7.01%, While the ADO is 2.56% in two microsatellites discovered simultaneous. Conclusion It provide an evidence of using this technique for the PGD for ADPKD.

【Key words】 Microsatellite ADPKD Preimplantation genetic diagnosis 常染色体显性多囊肾疾病(autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)是最常见的常染色体显性遗传的单基因遗传病，人群发病率为1/1000[1]。ADPKD的主要表现为肾脏进行性囊性改变，常导致终末期肾病，居我国终末期肾病病因的第4位[2]。除了肾脏病变外，还累及全身多个器官，如肝囊肿、高血压、颅内动脉瘤、心瓣膜畸形等，是一全身性疾病。而且ADPKD具有延迟性发病的特点，其症状发生前检查结果很少能影响未生育患者的生育意向，使其成为最易遗传给下一代的严重遗传病之一。因此，对ADPKD患者进行PGD既可满足患者生育的愿望，又可避免生育患有ADPKD的后代。目前认为，ADPKD主要与PKD1和PKD2基因有关，PKD1突变引起的ADPKD占80%～85%[3，4]，PKD2基因突变引起的ADPKD占10%～15%[5]，这两个基因结构复杂，缺乏突变热点，因此难以通过直接检测突变行PGD诊断。本研究拟利用与PKD1紧密连锁的KG8、SM6、CW4和CW2四个微卫星位点，行四重巢式荧光PCR和毛细管电泳，为ADPKD的PGD研究提供诊断依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 任取2位来本中心就诊患者的淋巴细胞64个，其中A患者获取18个，B患者46个。取材均得到患者的同意。

1.2 实验方法 (1)单个淋巴细胞制备：先用percoll 60分离出单个核细胞，然后在倒置显微镜下通过显微操作吸取单个淋巴细胞，分别在3滴PBS液中洗涤，同时取最后1个微滴洗涤后液体为阴性对照，将单个淋巴细胞转移于含5μl细胞裂解液的PCR管中，-20℃保存备用。(2)PCR反应：KG8、CW4和CW2的内引物参考文献[6]，其余引物均由primer 3软件自动生成。内引物中正引物均有FAM荧光标记。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体内外引物序列见表1。第一轮PCR：64个淋巴细胞均应用四重巢式PCR，同时扩增微卫星KG8、SM6、CW4、CW2，反应体系均为50μl，其中模板含5μl细胞裂解液的单个卵裂球，10×PCR buffer 4.5μl，dNTP 3μl(10mmol/L)，镁离子4.5μl(50mmol/L)，KG8和CW2正反引物各加2μl(10μmol/L)，SM6和CW4引物各加3μl(10uμmol/L)，High Fidelity Taq酶0.3μl，用水补充至50μl。先灭活蛋白酶K，45℃ 1min，96℃ 20min，然后在72℃时将上述反应液加入到模板里，96℃ 1min，96℃ 30s，58℃ 1.5min，72℃ 1min，共25个循环，最后72℃再延伸10min。10 PCR buffer、dNTP、镁离子和酶均由invitrogen公司。第二轮PCR：反应体系均为10μl，KG8反应体系为10×PCR buffer1μl，10mM的dNTP 0.5μl，5mM镁离子1.4μl，10μM的KG8正反引物各0.4μl，模板1μl，High Fidelity Taq酶0.07μl，最后用水补充至10μl;PCR循环条件96℃ 4min,96℃ 45s,58℃ 45s，72℃ 30s，共36个循环,最后72℃再延伸10min。SM6、CW4、CW2、镁离子浓度依次为0.9mmol/L、1.1mmol/L、0.9mmol/L，退火温度依次为60℃、60℃、55℃，其余条件都等同于KG8。(3)电泳：扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，出现预期条带的样品继续扩增45μl进行毛细管电泳，做STR(short tandem repeats，STR)分型(由上海基康公司和上海联合基因提供服务)。 表1 四个微卫星位点的内外引物序列

2 结果

2.1 CW4、CW2、KG8微卫星位点信息 A患者CW4和CW2位点有多态性信息，B患者KG8和CW2位点有多态性信息。

2.2 单个淋巴细胞扩增成功率 64个淋巴细胞有59个扩增成功，扩增成功率为92.18%，其中KG8扩增成功率为85.93%(55/64)，SM6扩增成功率为89.06%(57/64)，CW4扩增成功率为92.18%(59/64)，CW2扩增成功率为89.06%(57/64)。

2.3 等位基因脱扣率 KG8的等位基因脱扣率为25.64%(10/39)，CW4的等位基因脱扣率为25%(4/16)，CW2的等位基因脱扣率为7.01%(4/57)，在B患者中有1个淋巴细胞的两个位点同时发生ADO，发生率为2.56%(1/39)。

2.4 阴性对照 阴性对照未发现阳性结果。

3 讨论

ADPKD是一全身性疾病，目前尚无特异的治疗措施，只是一些对症治疗和延缓多囊肾病向ESRD进展的干预措施，多数患者最终将发展到终末期肾衰而不得不进行肾脏替代治疗和肾移植手术。为此，有必要对有ADPKD发病倾向的家庭成员，进行症状前诊断，以改变其生活方式，远离高危致病因素，达到延缓和防止该病的发生。

伴随着辅助生殖技术日益成熟的今天，PGD越来越受到世人的关注，对配子或着床前的胚胎进行遗传物质分析，选择没有遗传物质异常的胚胎移植，既能防止患儿的出生，又能避免流产、引产给夫妇双方带来的生理和心理上创伤。自1990年诞生了世界第一例经PGD的健康女婴以来[7]，世界上已经进行了6000多个PGD周期、至少1000个左右的经PGD诊断后的正常孩子出生[8]。但是由于ADPKD的致病基因庞大、结构复杂，有较多的重复序列、突变可能涉及整个基因，种类多并缺乏突变热点，因此目前ADPKD常用的遗传学诊断方法是采用对与致病基因紧密连锁的微卫星进行连锁分析。本研究应用的与PKD1连锁的KG8、SM6、CW4和CW2在中国人群中是高度多态的[6]。2004年Verlinskey等[9]、2005年Rycke等[10]均利用微卫星为连锁标记，相继在ADPKD的PGD上获得成功。

PGD主要诊断材料来源是卵裂球细胞，活检卵裂球既要保证检测结果正确，又不能影响胚胎的发育，这才是最佳的诊断方法。在单基因疾病的PGD中主要采用的方法是PCR，加上每次的PGD只能选取1～2个卵裂球，在模板量极其有限的情况下，PCR扩增失败、污染、等位基因脱扣等都将导致诊断错误或者根本无法得到诊断结果。本研究多重PCR的扩增成功率高达92.18%，研究中应用的单个淋巴细胞的清洗、转移均在显微镜下操作，确保淋巴细胞放入到PCR管中用蛋白酶K裂解细胞，确保细胞裂解充分。本研究中四重PCR中，四个微卫星位点的扩增成功率也不同，原因可能为DNA部分降解或者裂解不充分。

单细胞PCR存在另一个问题是可能发生ADO，即2条等位基因只扩增出1条，是导致PGD误诊的另一重要原因。引起ADO的确切原因尚未知晓，Piyamongkol等[11]研究表明ADO可能与扩增片段的长度、DNA降解数量、细胞的冻融、PCR程序、同时扩增的单细胞数量有关，与局部DNA序列、变性温度和细胞类型无关，即使在最有经验的PGD实验室的ADO率也达5%～15%。本研究采用多重PCR、荧光PCR及同时检测多个微卫星位点可降低由于ADO导致的误诊。本研究中KG8、CW4和CW2的等位基因脱扣率分别为25.64%、25%、7.01%，在B患者中有1个淋巴细胞的两个位点同时发生ADO，发生率为2.56%(1/39)，与Rechitsky等[12]在囊性纤维化(CF)的PGD诊断中报道一致，因此多重PCR同时扩增多个微卫星位点可以减少由于ADO而导致的PGD误诊率。Wirawit等[11]报道同时用两个细胞分析可使ADO的发生率从23.8%下降到3.8%。在今后的临床工作中，尽量选取两个或以上的卵裂球，同时扩增多个微卫星位点，以增加减少由于ADO引起的误诊率。

污染问题也是导致PGD误诊的又一重要因素，PGD的材料是单个卵裂球，其污染物主要来源于透明带内残余的精子及母体的卵泡细胞，这样应用卵胞浆内单精子注射，避免精子的污染，获取的卵裂球经多道PBS清洗。污染也可来自于空气中的气溶胶，在临床诊断的过程中，应严格实验操作，避免人为的污染。本实验未发现污染。

荧光PCR与常规PCR所不同的是将荧光染料标记在寡核苷酸引物上，通过荧光的激发来检测扩增产物，该方法最突出的优点是敏感性比常规PCR提高了1000倍，等位基因检测的信号只有另一个等位基因的1%甚至更少时，都能检测出来，从而减少ADO现象引起的误诊。多重PCR同时扩增多个微卫星位点还可以避免由于基因重组引起的误诊。

总之，本研究应用的单细胞多重荧光PCR，扩增成功率高、ADO率低，同时扩增多个微卫星可以降低由于ADO和基因重组引起的PGD误诊，为ADPKD行PGD打下了基础。

【参考文献】

1 Boucher C, Sandford R. Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD, MIM 173900, PKD1 and PKD2 genes, protein products known as polycystin-1 and polycystin-2). Eur J Hum Genet,2004,12(5):347～354.

2 梅长林,戴兵.多囊肾病慢性进展的分子发病机制及治疗进展.中国实用内科杂志，2007，27(1):53～55.

3 Burn TC, Connors TD, Dackowski WR, et al. Analysis of the genomic sequence for the autosomal dominant polycystic kidney disease (PKD1) gene predicts the presence of a leucine-rich repeat. The American PKD1 Consortium (APKD1 Consortium). Human Molecular Genetics,1995,4(4):575～582.

4 Hughes J, Ward CJ, Peral B, et al. The polycystic kidney disease 1 (PKD1) gene encodes a novel protein with multiple cell recognition domains. Nature Genetics,1995,10(2):151～160.

5 Mochizuki T, Wu G, Hayashi T. et al. PKD2 a gene for polycystic kidney disease that encodes an integral mem brane protein. Science (New York, NY,1996,272(5266):1339～1342.

6 孙岩,丁兰,王有麒,等.一个可能与PKD2基因连锁的常染色体显性多囊肾病家系.中华医学遗传学杂志，2005，22(5):554～556.

7 Handyside AH, Kontogianni EH, Hardy K, et al. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification. Nature,1990,344(6268):768～770.

8 Verlinsky Y, Cohen J, Munne S, et al. Over a decade of experience with preimplantation genetic diagnosis: a multicenter report. Fertility and Sterility,2004,82(2):292～294.

9 Verlinsky Y, Rechitsky S, Verlinsky O, et al. Preimplantation genetic diagnosis for polycystic kidney disease. Fertility and Sterility,2004,82(4):926～929.

10 De-Rycke M, Georgiou I, Sermon K, et al. PGD for autosomal dominant polycystic kidney disease type 1. Molecular Human Reproduction,2005,11(1):65～71.

11 Piyamongkol W, Bermudez MG, Harper JC, et al. Detailed investigation of factors influencing amplification efficiency and allele drop-out in single cell PCR: implications for preimplantation genetic diagnosis. Molecular Human Reproduction,2003,9(7):411～420.

12 Rechitsky S, Strom C, Verlinsky O, et al. Allele dropout in polar bodies and blastomeres. Journal of assisted reproduction and Genetics,1998,15(5):253～257.