高效毛细管电泳在中药指纹图谱应用

高效毛细管电泳(HPEC)是20世纪末发展的一种高效、快速的分离技术，是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。从1967年Hejerten发表的博士论文，到1981年Jorgenson和Lukacs发表的研究论文对毛细管电泳的发展作出了决定性的贡献[1]。20世纪80年代后期，HPCE在全世界范围内得到了迅速的发展，特别是在化学、生命科学、临床医学、药学等领域得到了广泛的应用，在中药学方面的应用也将引起了人们的高度重视。1　高效毛细管电泳的基本原理及概述原理[2] CE 统指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。其仪器包括一个高压电源，一根毛细管，一个检测器及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。CE所用的石英毛细管柱，在pH > 3情况下，其内表面带负电，和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下，正离子的运动方向和电渗流一致，最先流出;中性粒子的迁移速度相当于电渗流速度;负离子将在中性粒子之后流出，从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。中药品种繁多，成分多样，药材的质量受到很多因素的制约。中药材产地、种植方法、生长环境、采收期不同及加工过程不同，都会在不同程度的影响中药材的质量，因此保证药品质量、提高药物疗效是迫在眉睫的问题。随着科学技术的进步，各种先进仪器的不断更新换代，分离和分析中草药的仪器日益增多，近几年HPCE技术是分析化学中发展最为迅速的技术之一。2　中草药指纹图谱的基本概述中药指纹图谱[3]是基于中药总体识别的观念，以系统的化学成分结合药理学研究为基础，采用一定的分析手段，将中药的药效和化学成分的相关性以图谱的形式描绘出来，以鉴别真伪，辨别优劣。中药指纹图谱[4]的基本属性是整体性和模糊性。模糊性强调的是对照样品与待测样品指纹图谱的相似性，而不是完全相同。整体性是强调完整地比较色谱的特征面貌，而不是将其肢解。这两种属性是来源于中药作为天然产物本身的不确定性，以及后生代谢产物受环境影响带来的变异。所以分析指纹图谱强调的是准确的辨认，而不是精密的计算;比较图谱强调的是相似而不是相同。因此，中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段，在现阶段，通过指纹特征相似程度的比较，判断真伪、评价优劣、考察稳定性和一致性，是一种符合中药特色的质量控制模式之一。3　高效毛细管电泳技术在中药指纹图谱中的应用3.1　在植物药中的应用中药指纹图谱是国际公认的控制中药或天然药物质量最有效的方法之一，也是我国中药走向现代化的一个重要内容，毛细管电泳法的应用可为药材及制剂的鉴别及质量评价提供更加全面可靠的依据。刘海兴[5]等通过改变硼砂溶液的浓度、运行电压、溶液酸度，分析图谱峰的优化分离条件，从而确定硼砂溶液浓度20mmol/ L、运行电压20 kV、pH值为8.88。结果共标示出23个共有峰，以此23个共有峰分析，HPCE指纹图谱的精密度、稳定性、重现性良好。此方法准确、可靠、稳定性好，可作为中药月季花的HPCE 指纹图谱。孙国祥[6]等比较了10个不同产地的连翘药材，建立了连翘药材的毛细管电泳指纹图谱，方法快速，简便，重现性好，可用于连翘药材质量的有效评价。孙国祥等[7]以10 个不同产地的玄参用水回流提取后，用50 mmol?L-1硼砂溶解制得样品，以5-羟甲基糖醛(5- HMF)、哈巴俄苷、肉桂酸作对照品，用石英毛细管柱，以50 mmol?L-1硼砂溶液作缓冲液，在运行电压12.1 kV、电流约0.108 mA、紫外检测波长280 nm 条件下进行分析，获得不同产地玄参药材的指纹图谱，建立了HPCE 指纹图谱。并具有良好的重现性与精密度，按共有峰出现率f i=100%计，确定玄参药材中的10个中药指纹峰。并以对照品对不同产地玄参的HPCE指纹图谱进行评价，得出3产地质量完全合格，4产地含量明显偏低，3产地含量明显偏高，为玄参药材及其制剂的质量控制提供了新的依据。孙昕等[8]采用CZE法，建立了10批红花道地药材的指纹图谱，并与9个产地的红花药材以及红花的对照药材加以比较。结果表明不同产地红花药材的指纹图谱中，共有峰的相对峰面积有一定的差别。Ke Yu[9]等采用中心组合设计法和多变量分析法建立了黄芩的毛细管电泳指纹图谱，并在适当的电泳条件下定量测定了黄芩中的黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素，指纹图谱和定量分析可用来作为评价黄芩质量的一种方法。刘金丹等[10]模仿工业化用乙醇回流提取水沉再进一步纯化对甜瓜蒂进行成分分析，以50 mmol?L-1硼砂(含体积分数为5%的乙腈溶液)作为缓冲溶液，在12 kV电压下操作，紫外检测波长为228 nm，以10个不同产地药材的电泳图谱建立了甜瓜蒂CE指纹图谱，确立11 个共有峰，结合双定性双定量相似度评价法较好地实现了对甜瓜蒂药材质量的全面数字化控制，并为其它色谱指纹图谱方法研究及中药生产质量控制提供有益参考。曹敏等[11]采用50mmo?L-1硼酸盐+10 mmol?L-1磷酸盐为缓冲液，以内径50 μm、有效长度50 cm的CZE测定了栀子药材指纹图谱，探讨以栀子内在质量控释的标准。3.2　在动物药中的应用阎正[12]等，用5个不同产地的鹿茸，将鹿茸样品置于60℃干燥粉碎过筛后，加入无水乙醇热回流提取，过滤，滤液旋转蒸发回收，定容。阴冷处放置，取上层清液，滤膜滤过，取续滤液作为供试品。毛细管柱条件：未涂渍弹性石英毛细管柱(75μm×60cm);缓冲溶液：60～40 mmol尿素-硼砂混合溶液，检测波长200 nm，电泳电压20 kV，进样时间3 s，进样压力14 kPa，电泳温度为室温。该实验方法所建立的鹿茸的HPCE 的指纹图谱预处理方法简单，分离度较好，可为区别原产地与非原产地高端保健品鹿茸提供参考依据，并更全面的鹿茸质量评价方法的研究仍在进行中。王成芳等[13]用9个不同产地的蛤蚧，置于50℃ 恒温干燥加水超声，离心提取两次，合并上清液，定容，摇匀，用时0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品。毛细管电泳方法：以10mmol/L的硼砂-1% 乙腈(pH9～18)作为背景电解质缓冲液，柱温25 ℃，运行电压15 kV,230nm波长处检测，30min内完全分离。建立的指纹图谱中共有7个共有峰，且方法学考察达到标准。该方法具有良好的精密度和分离效果，可作为蛤蚧药材的质量控制方法。王成芳[14]用10个不同产地的蜈蚣药材，将其置于烘箱内50℃恒温干燥，粉碎，过筛，加水超声，离心过微孔滤膜作为供试品。以40mmol/L硼砂-0.2mol/L硼酸为缓冲溶液，pH8.9，分离电压20KV，柱温25℃，检测波长256nm，测定蜈蚣药材商品HPCE指纹图谱，得到7个共有峰，各共有峰相对峰面积的RSD%值在17%～64%之间，此法对蜈蚣药材商品进行品种鉴别，同时也可以作为其质量控制的方法。3.3　在中药制剂中的应用由于药物的配伍使用，使制剂的成分更加复杂，有效成分的研究和药物质量的控制已经引起了全球的广泛重视。郭涛[15]等建立了心舒口服液的毛细管电泳指纹图谱，并确立了制剂和药材指纹图谱之间的相关性，对心舒口服液进行了质量控制。孙国祥[16]等建立了苦碟子注射液的毛细管区带电泳指纹图谱，该法精密度和重现性好，为其质量控制建立了一种的新的评价方法。季一兵[17]等建立生脉散指纹图谱的基础上，可结合药效学实验，进而研究指纹图谱与药效之间的相关性，更能为生脉散质量评价和控制提供依据。4　高效毛细管电泳技术中药指纹图谱研究展望高效毛细管电泳技术在中药指纹图谱领域虽然起步的比较晚，但凭借着其独特的优越性，已经越来越受到认可。4.1　高效毛细管电泳技术与高效液相技术相比表1　与高效液相色谱比较4.2　展望采用与毛细管电泳技术其他进样技术联用、CE - NMR、HPLC- HPCE - MS、CE - MS - MS、CE - AES、CE - AFS、CE - ICP - MS以及不同电泳技术之间的联用，充分利用HPCE的高分离效率和MS或NMR的高定性鉴定性与灵敏度，能够完成复杂成分的分离与结构鉴定，可以建立中药材及其复方药物指纹图谱。随着新技术的发展，相信HPLC作为一种强有力的分析技术，将会在中药分析领域占据不可代替的地位。【参考文献】[1]　刘文英.药物分析[M].第五版，北京：人民卫生出版社，2004.[2]　曹敏，季一兵，陈玉英.栀子药材毛细管电泳指纹图谱的研究[J].中国药科大学学报，2002,33(4)：284.[3]　孙毓庆，孙国祥，金 郁.毛细管电泳指纹图谱及毛细管电泳2质谱联用在中药质量控制中的作用[J].色谱，2008,26(2)：160- 5.[4]　谢培山.中药色谱指纹图谱[M].北京：人民卫生出版社，2004：115.[5]　刘海兴，曹丽曼，万丽梅，等.中药月季毛细管电泳指纹图谱的研究[J].潍坊学院学报，2007,7(2)：74～79.[6]　王继贵.毛细管电泳[J].当代医师杂志，1997,2(10)：2.[7]　孙国祥，慕善学，侯志飞，等.连翘的毛细管电泳指纹图谱研究[J].色谱，2006,24(2)∶196～200.[8]　孙昕，隋因，郭涛.不同产地红花药材的高效毛细管电泳指纹图谱研究[J].中国药学杂志，2003,38(3)：176.[9]　KKe Yu，Yifei Gong，Zhongying Lin，et al.Quantitative analysis and chromatographic finger printing for the quality evaluation of Scutellariabaicalensis Georgi using capillary electrophoresis[J].J Pharm B iom Anal,2007,43(2)：.540～548.[10]　刘金丹，孙国祥，池剑玲.甜瓜蒂的毛细管电泳数字化指纹图谱[J].沈阳药科大学学报，2008,25(7)：556.[11]　罗国安，王义明.毛细管电泳的原理及应用.(第一讲)[J].毛细管电泳简介.色谱，1995,13(4)：254 -256.[12]　阎正，苑若瑶，王春云，张智慧，蔡立鹏，等.鹿茸HPCE 指纹图谱的研究[J].食品科技.2009,34(4)：254～258.[13]　王成芳，包永睿，孟宪生，等.蛤蚧药材高效毛细管电泳指纹图谱研究[J].中药材.2010,33(3)：337～339.[14]　王成芳.动物药材商品高效毛细管电泳指纹图谱的研究[J].2010：32～36.[15]　郭涛，隋因，孙沂，等.心舒口服液毛细管电泳指纹图谱的研究[J].中草药，2006,37(6)∶839～843.[16]　孙国祥，董玉霞，慕善学，等.苦碟子注射液毛细管电泳指纹图谱[J].沈阳药科大学学报，2006,23(4)∶233～236.[17]　季一兵，范晓梅，朱丹妮.复方生脉散的毛细管电泳指纹图谱研究[J].中成药.2010,32(8)：1277～1281.[18]　王天松.毛细管电泳与中草药指纹图谱[J].中成药，2000,22(6)：397～399.