健脾养胃方对人胃腺癌SGC7901细胞株的生长抑制和诱导凋亡作用的实验研究

胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居于各种恶性肿瘤的前位[fi-Zl，对人类的生命和健康造成极大的威胁。我国是胃癌的高发区，预计今后若干年内胃癌的发病率还将持续上升一，其防治是当前医学研究的重点和难点，也是我国对重大疾病防治工作的重点领域。化疗是胃癌的重要治疗手段，然而新药、新方案的出现并未能使其有效率显著提高，中医药作为肿瘤综合治疗的手段之一被临床广泛应用。目前普遍认为中医药在预防肿瘤增强患者的免疫功能，对放化疗的解毒增效，抗复发转移及延长患者的生存期，改善生活质量等方面均有其独特作用。多年来，大量临床研究结果表明，以健脾养胃方为基础的中医药治疗可以降低胃癌术后复发转移[LO，本实验拟对其作用机理进行进一步探讨。

1实验材料

人胃腺癌SGC7901细胞，由江苏省中医院肿瘤科实验室提供。RPMI1640培养基购自GIBCO公司，新生牛血清购自杭州四季清生物技术有限公司，胰酶蛋白粉、PBS粉、MTT(四甲基偶氮哇盐)购自Sigma公司，二甲基亚矾(DMSO)购自上海凌峰公司。Matrigel胶、AnnexinV-FITC凋亡试剂盒购自美国BD公司

2实验方法

2.1健脾养胃方的制备健脾养胃方由生、炙黄蔑，党参，获菩，炒白术，当归，自芍，陈皮，半夏，三棱，羲术，石见穿，白花蛇舌草，炒谷麦芽，焦檀曲，炙甘草组成。制备方法:将药物加人10倍量水，浸泡1h，加热2h，回收药液，药渣中加人之前一半量的水.再次煎煮2h后.回收药液。合并2次药液.讨滤并浓缩至所需浓度，4℃冰箱保存备用。以上药液由江苏省中医院制剂部提供

2.2实验分组实验组:临用前将中药加人RPMI1640培养液，浓度分别为2mg/mL,4m岁mL,bmg/mL空白组:不加任何药物。西药组:加人5-FuJ 

2.3买验步骤

2.3.1酶联免疫检测药物对人胃腺癌SGC7901细胞增殖作用的影响卜刀在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中常规培养细胞，在细胞达到指数增长期时开展实验。消化细胞，离心，收集细胞，接种于96孔板，置370C,5%COZ温箱培养48h，使其贴壁生长。吸弃培养液，加人含有不同浓度药物的RPMI1640培养液200协L，继续培养48h。倾倒培养液，PBS洗2次，每孔加人200,L含10%小牛血清RPMI1640+20}.L M'I`T培养液，继续培养4h。吸掉上清，每孔加人150}L DMSO，置摇床上低速振荡l Omin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。重复3次。抑制率=(1一实验组OD值/对照组OD值)x 100%

2.3.2药物对人胃腺癌SGC7901细胞侵袭力的影响[[8-9}按上述方法培养细胞，接种于l Ocm培养皿中，置370C,5%COZ温箱培养24h，使其贴壁生长。加人含有不同浓度药物的RPMI1640培养液，继续培养48h。在滤膜的上下表面分别铺以S}tg matrigel，超净工作台中过夜干燥。使用前水化基底膜，将transwell小室放人培养板中。各实验组细胞饥饿处理，重悬于含无血清的培养基中。上室按1 x106/mL密度加人200}1}细胞悬液，下室加人300闷含10%小牛血清的RPMI1640培养液+300}L趋化因子，常规培养。24h后取出滤膜，棉签擦去滤膜上层细胞，移去小室，倒置，风干;滤膜底部加SO},L含0.1%结晶紫，风干，PBS清洗;将膜取下，直径上取5个视野，照相，计数。按以下公式计算细胞的侵袭抑制率:细胞侵袭抑制率=(1一实验组侵袭细胞数/空白组侵袭细胞数)x 100%2.

2.3.3流式细胞仪检测药物对人胃腺癌SGC7901细胞凋亡的影响

按上述方法培养细胞，接种于细胞培养皿。继续培养细胞，使细胞贴壁，培养至细胞基本覆盖培养皿底部。倾倒培养液，加人含有不同药物的RPMI1640培养液，继续培养于370C,5%CO:温箱。培养48h后，收集细胞培养液，收集所有细胞(加人300N,L 1X Binding Buffer缓冲液重悬细胞，将细胞转移至流式管中，加人,L的FITC Annexin V,S,L的PI，在避光处轻轻摇晃培养管，孵育细胞15min,250C。用流式细胞仪检测。

2.3.4流式细胞仪检侧药物对人胃腺癌SGC7901细胞周期的影响[12-13J接种细胞，使细胞贴壁，培养至细胞基本覆盖培养皿底部。倾倒培养液加人含有不同药物的RPMI l 640培养液，继续培养于370C,5%CO:温箱。培养48h后，收集细胞培养液，用PBS洗细胞2次，消化，收集所有细胞。离心，再用PBS洗细胞2次，吸弃PBS。加人75%乙醇.于40C固定4h以上。1500r/min离心Smin，弃上清，以3mL的PBS洗涤I次，加人400},L嗅化乙锭(PI,SON,g/mL),100N,L RNase A(100N,g/mL),40C避光孵育30min。用流式细胞仪检测

3实验结果

3.1药物对人胃腺癌SGC7901细胞增殖作用的影响结果见表1。健脾养胃方作用SGC7901细胞48h后，对细胞增殖有显著的抑制作用。高剂量组药物的抑制率可达88.06%.中刑量组的抑制率为56.70%，低剂量组的抑制率为34.24%经t检验，与空白组比较，差异均有统计学意义(P<0.005)。

3.2药物对人胃腺癌SGC7901细胞侵袭力的影响结果见表2。各组药物作用SGC7901细胞24h后侵袭细胞数均低于空白组(P<0.001)0空白组细胞轮廓清晰、活力旺盛，各药物组细胞变圆、稀疏，且呈现剂量相关性(见图1)0 3.3药物对人胃腺癌SGC7901细胞调亡的影响见表3、图2。健脾养胃方高剂量、中剂量组细胞凋亡数明显高于空白组，并呈浓度依赖性，表现出明显的量效关系(P<0.01)o 

3.4流式细胞仪检测健脾养胃方对人胃腺癌SGC7901细胞周期的影响结果见表4、图3。不同浓度健脾养胃方作用48h，可以影响SGC-7901细胞周期分布，使GZ/M期比例增高，与空白组比较差异显著(P<0.05)o在健脾养胃方浓度达4mg/mL时，Gz/M期细胞比例增至17.64%，在GI峰前可见明显凋亡峰。浓度为6mg/mL中药组细胞死亡较多，结果无意义

4讨论

中医学认为，胃癌的发生与六淫、饮食、七情有关，脾胃虚弱是其基本病机，虚、痰、窟、毒是其主要病理机制。我省名中医刘沈林教授总结多年临床经验，根据胃癌脾胃虚弱这一主要病机，提出以健脾养胃为主的治疗原则，并创健脾养胃方，在临床上治疗胃癌患者，特别是中晚期胃癌患者，取得了较好的临床疗效。该方由炙黄蔑、党参、炒白术、当归、白芍、羲术、石见穿、炙甘草等中药组成。方中炙黄蔑为补脾益气之要药，党参、白术、甘草取四君子汤之意，益气健脾;羲术、石见穿活血行气消积。全方有健脾养胃、活血化疲之功，正合胃癌脾胃虚弱之主要病机。多年来，我们运用该方治疗进展期胃癌并进行了大量的临床研究，结果显示其可以较好地缓解消化道肿瘤患者，特别是胃癌患者的临床症状，恢复体力，增加体重，提高免疫功能，减轻其他治疗的毒副反应，降低复发转移，提高生活质量，延长生存期。本实验以人胃腺癌SGC7901细胞为载体，开展了健脾养胃方对胃癌细胞生长抑制和诱导凋亡作用的研究。实验结果显示:健脾养胃方有抑制人胃腺癌SGC7901细胞增殖的作用，高剂量组对细胞的增殖抑制率最高，达到88.06%;运用健脾养胃方作用细胞24h后，侵袭的细胞数明显减少;该方作用细胞48h后可以诱导肿瘤细胞凋亡，还可诱导肿瘤细胞GZ/M期周期阻滞。这一研究结果为健脾养胃方治疗胃癌提供了可靠的实验依据。在此基础_r，我们还将对该方的信号转导通路行进一步的实验研究，以从分子层面深人探讨其作用机制，为中药复方治疗肿瘤提供新的理论依据。

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