基于核磁共振技术的小青龙汤证的证本质研究

代谢组学是系统生物学中继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科,是对病理生理刺激或基因改变时生物体系的动态代谢响应所进行的多参数定量分析[1]。样品代谢产物的检测方法包括核磁共振(NMR)、气相色谱一质谱联用技术(GC/MS)、液相色谱一质谱联用技术(LC/MS)和高效毛细管电色谱(CEC)等技术,其中NMR的应用最为广泛。作为代谢组学研究的核心技术,NMR以其高分辨率和高灵敏度对体液或组织内许多微量代谢物进行检测,可得到相应的生物体代谢物信息。研究这些微量代谢组分的NMR图谱,综合分析这些信息所反映的生物学意义,可以了解生物体代谢的规律。

小青龙汤证源于张仲景的《伤寒论》,原文第细条、41条提出小青龙汤证的主要病机是外寒内饮,本课题就是根据外寒内饮这一病机来制作小青龙汤病证模型,并以动物行为学和免疫学等方法来进行确定。通过利用核磁共振技术对小青龙汤证生物学本质的研究,为小青龙汤证辨证的科学化和定量化寻找新的思路和途径。

材料和方法

1.动物与分组:实验用雄性Wistar大鼠16只,体重(2OO±10)g,由中国中医科学院中国协和医科大学动物研究所提供,合格证号为SCXK(京)2009-⒛04。适应性饲养7d后,随机分为正常组和模型组,每组8只,动物每笼4只群养,饲养于普通级动物房,室内温度保持为(20±2)℃,相对湿度保持为40%~50%。

2.造模方法:参照阻塞性肺气肿(COPD)寒饮蕴肺证造模方法[24],结合中医理论制作外寒内饮(小青龙汤)证模型,将模型组大鼠放置于寒冷环境(控制室内温度在10℃左右)中喂养,每天在低温环境下(0±4℃左右)冷冻1h,并将大鼠放入冰水中游泳,以水面淹没大鼠鼻尖时将大鼠捞出,持续4周,同时进寒凉饮食(冷冻饲料及冰水)。正常组不做任何处理。

3.取材与处理:分别于造模前,造模后即第7天和第38天称体重,用代谢笼收集24h尿液,收集尿液时禁食不禁水,于38d收集尿液后,腹腔注射10%的水合氯醛(按0.35mL/100g)麻醉,打开腹腔,由腹主动脉采血约5mL,室温下静置2h,3000r·min-l离心10min,取上清液于-8O℃冰箱保存各用。

4.检测指标和方法:(1)血液IL-8的测定:大鼠IL-8ELISA试剂盒由上海研吉生物技术有限公司提供,型号:DIE30583(依照试剂盒说明书进行)。(2)尿液NMR数据采集:尿液各样方法:冰水混合溶液解冻尿液样品,取尿液500uL于EP管中,加PBS200mL,加重水锁场,0.03%的TSP作为化学位移参照,之后转入EP管中,在4℃条件下,以13000r·min-1离心20min,取上清液200uL于内径5mm的核磁管中。在山西省测试分析中心核磁共振实验室进行检测,25℃条件下,使用由德国布鲁克公司提供的Bmker600-MHZAⅤANCEⅢ核磁仪,调用NOESY序列,弛豫延迟(RD)为2.0s,混合时间(tm)为0.10s;扫描64次;谱宽8O00Hz;驰豫时间2s,采样点数32k,累加次数“次。用MestRenova核磁图谱专业处理软件对所有NMR图谱进行傅里叶转换并进行基线、相位调整,同时以咒P的化学位移(0.0)为标准对图谱进行化学位移的校正,对0.50~10,mppm每段为0。⒄ppm共分为230个区域进行分段积分,得到与化学位移相对应的积分值后,以文本文档和Excd文件保存,采用面归一化法对积分数据归一化之后,用于模式识别分析。

5.统计学分析:运用mMcA-P+软件将尿液核磁积分数据进行中心化和规格化后进行主成分分析,以主成分矢量为坐标轴作图,可以反映类别间的差异,数据的主成分载荷图能反映导致差异的主要代谢物。所有数据以均数±标准差(x±s)表示,运用SPSS17.0软件采用独立样本r检验进行分析(必要时运用校正莎检验和非参数检验),以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.行为学观察:(1)模型组:消瘦、反应迟钝、行动迟缓、爱扎堆、饮食减少、皮色失去光泽、立毛、拱背、蜷曲、畏寒肢冷、打喷嚏、咳嗽、呼吸急速、喘息、多尿、大便稀。(2)正常组:活跃、毛色光滑、饮食正常,未出现上述症状。

2.血液IL-8的测定结果:两组采用独立样本莎检验得莎t=16.21,P<0.05,正常组与模型组IL-8浓度差异有统计学意义,模型组的IL-8浓度高于正常组。结果见表1。

3.尿液NMR检测结果

(1)两组大鼠尿液氢谱:模型组与正常组大鼠尿液典型1HNMR,结果见图1。可见两组之间有明显的差别。

(2)PCA结果:16只大鼠尿液氢谱积分值的PCA结果见图2。正常组和模型组大致以d轴方向分开,正常组与模型组之间无交叉和重叠。说明两组分开较好,显示造模成功。

(3)尿液样本中潜在生物标志物的寻找:为了寻找引起模型组与正常组之间发生显著差别的生物标记物,对两组PCA的Loading图(见图3) (见图4)进行分析,同时结合相关文献[59],找出对分组贡献最大的标志物(在PCA的bading图中,离原点越大的点对分组贡献越大,抬图中纵轴上的值离基线越远,对分组贡献越大)。再结合叩SS软件对位于边缘标志物的峰面积进行莎检验,表2显示了模型组与正常组之间生物标志物及其变化的结果,其中P(0,O~,ˉ的代谢物为潜在生物标志物。讨论小青龙汤证的主要病机是内有水饮停聚,又外感寒邪。肺为水之上源,主行水,太阳病失治,则肺宣降失常,水液不行而成饮邪,又复外感寒邪,表里同病,以里证为主。水寒相搏,水停胃中则干呕;渍于肠间,清浊不分则下利;蓄于下焦,气化不利则小便不利,甚者少腹满;还有口渴、咳嗽、喘、噎、短气等或然证。结合我们前期的文献及临床研究,小青龙汤的主要表现为咳、痰、喘[10]。临床上小青龙汤常用于呼吸系统疾病,如慢性支气管炎、阻塞性肺气肿等病机为外寒内饮的疾病治疗。本模型是从外寒(低温饲养,冰水游泳,冷冻1h)和内饮(喝冰水,食冰冻食物)两方面造模,且1个月后模型组表现出“外寒内饮证”的一系列症状。IL-8是反映呼吸系统疾病的主要炎性细胞因子之一,主要来源于单核巨噬细胞、T淋巴细胞、内皮细胞、成纤维细胞等。其水平往往与局部浸润的单核细胞和中性粒细胞数平行,即IL-8水平越高,局部炎症越严重。IL-8通过趋化中性粒细胞、T淋巴细胞在气道黏膜积聚,激活中性粒细胞脱颗粒及呼吸爆发反应[11],从而引起气道高反应性及哮喘。

本课题用ELISA法测定血液中IL-8的浓度,结果显示,模型组高于正常组且差异有统计学意义(P<0.05),说明模型组大鼠从造模方法、大鼠行为表现、生化指标上均很好的体现了呼吸系统疾病小青龙汤证“外寒内饮”者的特点。本课题的核磁研究结果显示,模型组与正常组相比,肌酸酐、胍基乙酸、三甲胺、牛磺酸、尿囊素等代谢物含量均有升高(P<0.O5),琥珀酸、2-0G、乳酸、甘氨酸、甲基烟碱等代谢物含量则降低(P<0.05),而这些物质都是与能量消耗和代谢有关的。模型组中大鼠磷酸肌酸、肌酸酐、胍基乙酸较高,乳酸降低,反映储存能量的物质减少,可提供的能量也减少,进而大鼠活动量相对减少,这与模型组大鼠神疲乏力、活动减少的行为相一致;大鼠在寒冷的刺激作用下,反射性消耗能量增多,储存能量物质减少,也可解释模型组体重减轻这一现象;模型组中牛磺酸较高,说明脂类消化较多,可解释模型组大鼠体重较轻;三甲胺、三甲基苷的升高,导致磷脂酰胆碱生成增多,进而活化细胞促进结肠蠕动,同时还有利尿作用,可以解释模型组大鼠大便稀薄、小便量多的症状;尿囊素的增高,抗炎作用增强,反映模型组大鼠有炎症,这也符合我们所研究的小青龙汤证主要是呼吸系统疾病的西医病理机制。总的来说,本模型组大鼠可能是因为外感寒邪而表现出了应激性的代谢增强,以致与代谢相关的物质(如肌酸酐、胍基乙酸、三甲胺等)发生改变;大鼠宿有的内饮,可能是因为肾功能不全导致水液代谢失常而引起,模型组中反映肾功能的尿肌酐的增高则可为其提供依据。综上所述,运用代谢组学方法从机体物质基础角度来探索小青汤证的证本质是可行的。

参考文献

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