LC-MS/MS方法定量测定人血浆中亮氨酸浓度及C-亮氨酸丰度

　　蛋白质是人体所必需的三大营养素之一，由20种氨基酸构成。其中人体自身不能合成或者合成速度不能满足机体需求的氨基酸有8种，称之为必需氨基酸，它们在人体利用食物蛋白质和发挥生理功能的过程中起着至关重要的作用对蛋白质和氨基酸人体需要量的探讨由来已久，经典方法是氮平衡法[2]。但是该方法存在一些不足之处，它是通过计算摄人与排出的氮来寻求两者的平衡点，进而找出适宜的摄人量，并不能说明蛋白质摄人体内分解为氨基酸后，在体内氨基酸代谢库中的动力学变化。另外，由于难以准确测定各种途径的氮损失，导致不能正确测量蛋自质的生理需要量。稳定同位素技术的发展为蛋白质需要量的研究提供了新的思路和手段，示踪剂氨基酸氧化法即是应用稳定同位素进行人体蛋白质需要量研究的一种方法。该方法是用一种必需氨基酸作为示踪剂，对机体内蛋白质和氨基酸的氧化过程进行动态观察，通过其氧化分解程度来反应机体对蛋白质和氨基酸的需要量。血浆中必需氨基酸的浓度和标记氨基酸的同位素丰度可以反应其氧化分解程度，从而对人体蛋白质的需要量进行分析。有关氨基酸同位素丰度测定的报道很少，而且基本上都是将样本衍生化后用GC一MS方法或LC一UV方法检测，操作步骤烦琐。　　本文选择8种必需氨基酸中的亮氨酸及其同位素标记物3C一亮氨酸作为研究对象，首次建立了一种快速、灵敏、特异的同时测定血浆中亮氨酸浓度和3C一亮氨酸丰度的LC一MS/MS方法。采用简单的蛋白沉淀方法进行样本制备，同时使用MRM采集模式，提高特异性。每个样本分析用时仅3min.　　1仪器与试药20A型高效液相色谱系统(日本岛津公司);配备电喷雾(ESI)离子源的API一4000型三重串联四极杆质谱仪(美国AppliedBiosystems公司);MilliQ纯水机;Heraeus低温高速离心机;MettlesToledoAX一105十万分之一分析天平。　　C一亮氨酸对照品购自CambridgeIsotopeLab-oratori,Inc公司，纯度是99.0%;亮氨酸对照品购自Sigma公司，纯度是98.0%。空白人血浆由北京协和医院提供。甲酸、乙睛均为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为去离子水。　　2试验方法　　2.1色谱条件采用Atlantics色谱柱(4.6mm*100mm,3.5Nm)，流动相为乙睛一水(0.1%甲酸)(5:95)，流速为1mL·min，进样量为20p/L;在室温条件进行分析。整个样本分析时间为3min.　　2.2质谱条件离子源:ES卜喷雾电压(IS);5kV;离子源温度(TEM);550℃;雾化气(IEB);50units;碰撞气(CAD);7unitso检测方式:正离子检测;扫描模式:多反应监测(MRM);用于定量的分析离子对分别为m/z132.1一、86.0(亮氨酸)Irralz133.1--X86.0(C-亮氨酸)，碰撞能(CE)为15ev.　　2.3标准溶液的配制　　精确称取亮氨酸对照品133.8mg(纯度98%)，置于10mL量瓶中，加人适量纯水，振荡溶解后定容至刻度，混匀得到浓度为100,i,mol·mL的母液，用于配制标准曲线工作液。按上述方法重复操作，得到另1份等浓度母液，用于配制质控样本。　　精密称取13一亮氨酸对照品10.O1mg(纯度99%)，转移至10mL量瓶中，以纯水定容至刻度，得到浓度为7.5A,mol·mL的母液。上述溶液置于一30℃保存。　　2.4样本处理方法取待测血浆50L，加人纯水50p}L,涡旋10s，加入沉淀剂乙睛250},L，涡旋30s，然后13000r·min‘离心5min，取上清液10L，加人纯水500,L,混匀后进样10,Lo2.5标准曲线和质控样本的配制2.5.1亮氨酸的标准曲线和质控样本将亮氨酸母液由高到低逐步用纯水进行稀释，得到浓度为50,100,200,400,500,800,1000nmol·mL的一系列工作液。量取空白血浆50},L，加人工作液50},L,涡旋10s，配制成含亮氨酸的系列标准血浆，按“2.4”项下同法操作。　　用空白血浆将另1份亮氨酸母液由高到低逐步稀释，得到3个浓度的质控样本，分别为L0(I00nmol·mL，lIOQ(200nmol·mL，HoQ(800nmol"mL。按“2.4”项下同法操作，进行样本制备。　　2.5.2'3C一亮氨酸丰度的标准曲线和质控样本取亮氨酸和C一亮氨酸的母液，用纯水稀释至等摩尔浓度(150nmol·mL)，并将两者以不同体积配制成系列摩尔浓度比值的工作液:0.O1,0.02,0.05,0.08,0.10.25,0.4,0.5。量取空白血浆50},L，加人工作液.50},L,涡旋10s，配制成不同摩尔浓度比的标准曲线样品，按“2.4”项下同法操作。其中，R表示‘3C一亮氨酸/亮氨酸的摩尔浓度比值。　　按下式计算‘3C一亮氨酸的同位素丰度:　　3C一亮氨酸丰度二‘3C一leu/('3C一leu+'2C一leu=1i(1十liR)]*100%.　　3结果　　3.1特异性分别对空自血浆及最低定量下、限样品(50nmol_·nl)进行前处理后进样分析，观察有无干扰峰出现。在本研究的测定条件下，人血浆中亮氨酸的保留时间约为1.8min。空白血浆相应保留时间处有于扰峰出现，但由于其峰面积小于最低定量下限(LL}DQ)样本峰面积的20%，认为对亮氨酸的定量分析没有影响。空白血浆样品色谱图和亮氨酸的LL}Q血浆样本色谱图见图1.　　3.2标准曲线的线性　　用亮氨酸的峰面积(Yj对其浓度(X)进行线性回归，1/XZ加权，得到典型的标准曲线方程:　　Y=310X+882r=0.9900　　结果表明，在50一1000nmolamL‘浓度范围内，亮氨酸的浓度与峰面积有良好的线性关系。　　用3C一亮氨酸与亮氨酸的峰面积比(Y)对两　　者摩尔浓度比值进行线性回归，1/Xz加权，得到典型的标准曲线方程:　　Y=1.OSX+0.0154r=0.9974　　结果表明，在0.01a0.5的摩尔浓度比范围内，两者摩尔浓度比与峰面积比有良好的线性关系。　　3.3批内、批间精密度与准确度制备含亮氨酸浓度分别为100,200,800nmol·mL的标准血浆以及‘}C一亮氨酸/亮氨酸摩尔浓度比为0.02,0.卜0.4的标准血浆各5份，按“2.4”项下操作并测定，记录其峰面积，按随行标准曲线回归方程计算浓度，并计算日内精密度。连续测定3批，考察方法的批间精密度。结果表明，此方法的精密度和准确度符合要求。见表1.　　3.4最低定量浓度制备含亮氨酸浓度为50nmol"mL’以及13C亮氨酸/亮氨酸摩尔浓度比为0.0i的标准血浆各5份，按“2.4”项下操作并测定，由随行操作处理的标准曲线定量，计算精密度和准确度。　　结果显示本法有良好的信噪比(SlN>10)。最低定量浓度以及摩尔浓度比的准确度(RE?分别为-3.2%和一0.$%，精密度(f1}D)分别为1.2%和1#.5%，完全满足定量分析的要求。　　3.5稳定性试验以亮氨酸浓度为i00,'200.,800nmol"mL‘以及’3C亮氨酸/亮氨酸摩尔浓度比为0.02,0.1,0.4的质控样本各5份为1组，共取4组样本，分别进行如下处理:按“2.4”项下方法对其中1组质控样本进行前处理后，在自动进样器中(10℃)放置24h后进样分析，考察自动进样器稳定性;另取2组质控样品，分别在室温(25℃)放置4h，在一30℃条件下放置1S0d后，按照“2.4”项下方一法处理并测定，考察血浆样品的室温放置稳定性及长期稳定性;再取一组质控样品，在一30℃条件下冷冻24h，取出后置于室温下，待其完全融化后，再置于一30℃条件下冷冻，反复操作3次后，按照"2.4”项下方法处理并测定，将测定值与理论值相比较，评估血浆样品中亮氨酸以及’3C一亮氨酸经过3次反复冻融后的稳定性经测定并统计分析，5次测量值的RSD均在15%以内，RF}在士15%以内，提示质控样本在上述实验条件下的稳定性良好。　　3.6萃取回收率及基质效应取亮氨酸浓度为100,200,800nmol·mL的质控样品各6份，按照F`2.4”项进行制备并测定，得到峰面积9同时，以空白血浆作为基质，按照“2.455项F方法处理，取出50}li，分别用含有低、中、高3种浓度的对照品溶液稀释后进行测定，得到峰面积B:}种浓度水平的对照品溶液直接进行稀释后测定，得到峰面积}r。峰面积孟与B的比值及B与C的比值分别为萃取回收率和基质效应。血浆中的亮氨酸在低、中、高3种浓度的萃取回收率。　　4方法的应用　　取20名健康成年男性为研究对象，分为2组，给予含有不同蛋白质量的日常膳食5d后，第6d经静脉滴注给予3C一亮氨酸，持续3h。在输液结束前的30min内每隔15min取1次血液样品，测定血浆中亮氨酸的浓度与3C一亮氨酸的丰度，并比较各时点丰度及浓度的差异。结果表明，z组受试者3个时间点亮氨酸的浓度与’3r一亮氨酸丰度之间的差异无统计学意义。在进食状态下持续给予受试者稳定同位素的过程中，不同时间点机体蛋白质和氨基酸的氧化分解处于相对稳定的状态，可以在此时期内确定1个同一的时间点来研究机体处于不同的蛋白质和氨基酸营养状态下的各项代谢动力学参数。　　5讨论与小结　　5.1本试验使用乙睛直接沉淀蛋白法处理样品，不需要进行衍生化等复杂的前处理，简便快捷，可以实现样本的快速，大规模制备，极大满足临床样本的分析测定的要求二5.2样本经过前处理后，一次进样就能同时获得亮氨酸的浓度和’3C一亮氨酸的丰度的数据，省去了反复进样分析的烦琐程序，节省大量时间和试剂，节约成本5.3亮氨酸是人体的必需氨基酸，在至白血浆中也会检测到其响应但其峰面积小于最低定量样本峰面积，不会影响其定量分析〔。另外，本方法由于稀释倍数较多，基本上没有基质效应，回收率都接近于。　　5.4在建立本定量分析法的过程中，曾对流动相的组成、配比、等液相色谱条件进行了优化，最终确立此有良好色谱行为的条件。此外，对质谱参数包括解离电压、碰撞能等电参数和雾化气、碰撞气等气参数进行了优化，确立可以进一步提高测定灵敏度的质谱方法。　　5.5"本文建立了同时检测血浆中亮氨酸浓度及3c一亮氨酸丰度的LC一1VVI方法。该方法简便，易操作，专属性强，重现性好，分析时间短，适用于大批量生物样品的测定。　　参考文献1 JI Yi-bing(姬一兵).Advance on the level of reference nutrient intake of protein and amino acid(蛋白质和氨基酸参考摄入量的研究进展).J Hyg Res(卫生研究),2007,36(1):1202 Scrimshawn S.Human protein requirements:a brief update.Food Nutr Bull,1996,17:1853 Youngv R,Borgonha S.Nitrogen and amino acid requirements.J Nutr, 2000,130(suppl):18414 Elango R,Humayun MA,Ball RO,et al.Evidence that protein requirements have been significantly underestimated.Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 2010,13:525 Young VR,Pellett PL.Proteinintake and requirements with reference to diet and health.Am J Clin Nutr,1987,45:1323