涂覆CD34抗体层的药物洗脱冠脉支架的生物相容性评价

　　冠心病是严重威胁人类生命健康的重大疾病，在世界范围内已得到广泛应用，但术后引起的损伤被称为人类的头号杀手。经皮腔内冠脉血管成形术反应一再狭窄始终是困扰介人治疗的难题。冠脉内percutaneoustransluminalcaronaryangioplasty,PI'一支架植人术的广泛应用，使1'TCA术后再狭窄率明idA)作为治疗冠心病的一种卓有成效的方法，显降低，但支架内再狭窄发生率仍在15%-22%。近年来，随着药物洗脱支架(drugelutingstems,DES)的应用，支架内再狭窄的发生率大大减少，应用DES被认为是支架植人后防止再狭窄最有希望的治疗手段之一.DES主要是在支架表面涂覆抗细胞增殖的药物，它可以抑制平滑肌细胞的攀附及增殖，同时，也抑制了血管内皮细胞的攀附及增殖，导致支架内皮化延迟;此外，血管豁膜下层与肌层长期暴露在血液中，一旦涂层药物洗脱完毕后，血管平滑肌细胞会不断增殖，造成支架内再狭窄的追赶效应L一。目前，科学家们一致认为内皮细胞层的损伤及内皮细胞功能紊乱与再狭窄有着密切的联系，支架植入体内后，由于不能快速被内皮细胞所覆盖，致使再狭窄概率较高。　　在本研究中，涂覆CD34抗体层的药物洗脱冠支架以316L不锈钢为基底材料，支架表面含35%雷帕霉素(西罗莫司),64:9%可生物降解高分子载体混合涂层、0.1%的抗氧化剂(丁基轻基甲苯)，可生物降解高分子载体由(乙交醋一co一D,乙一丙交醋)一(DzL一丙交酷)多嵌段共聚物与、乙交醋--c。一聚乙二醇一0一己内醋)一(乙交醋-eo}D,L一丙交醋)多嵌段共聚物的混合物组成，属于一种新型生物吸收聚氨醋连接的多嵌段共聚物。　　该支架还结合了内皮细胞、内皮祖细胞捕获技术通过在支架外层利用竣甲基葡聚糖将CD34抗体以共价结合的方式结合到支架的外表面，形成CD34抗体层，以此来促进血管内皮的快速愈合，并保持其完整性。预期通过球囊导管经人体股动脉或挠动脉将其植人结合到冠状动脉狭窄病变的部位，为冠状动脉狭窄病变处提供一个固定、支撑血管的装置，改善心肌供血量，实现血运重建。　　生物相容性是评价生物材料性能的重要指标之一，而体外试验和动物实验研究是对临床前检测新型生物医用材料是否具有良好的生物相容性的重要初筛手段。本研究应用细胞毒性试验.血性试验、皮内刺激试验、皮肤致敏试验、急性全身毒性试验及热原试验对该支架进行了生物相容性评价，为该支架的临床应用提供相应的安全性数据。　　1仪器与材料　　1.1仪器隔水式恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)，电子天平(瑞士梅特勒SETTLERAE240)，恒温摇床(上海}H}Y一1038)，电热水浴锅(上海HH.W21.420型)，低温离心机(美国I}OKUSANH-}80R),紫外可见分光光度计(日本日立有限公司U一3310),CO:培养箱(美国REVCO),倒置显微镜(日本Ol,yn}z}s)，微孔板测读仪(美国Thermo1500)。　　1.2供试品试剂涂覆}CI}34抗体层的药物洗脱冠脉支架(图1)由业聚医疗器械(深圳)有限公司提供;;0.9%氯化钠注射液(石家庄四药有限公司);柠檬酸钠(北京益利精细化学品有限公司，分析纯);胎牛血清、MFM培养基、胰酶('1'hermoFisher生物化学制品北京有限公司)，弗氏完全佐剂(F'5881)1}3实验动物实验动物选用3月龄新西兰家兔、昆明种雄性小白鼠和初成年白化豚鼠，新西兰家兔体重2.0一2.}kg，雌雄不限，雌兔无孕;昆明种雄性小白鼠体重1}N21g;白化豚鼠体重为321}345g且为同一性别。所有实验动物均由中国食品药品检定研究院实验动物繁育中心、提供及饲养，饲养条件温度22一25℃，湿度40%一SO}lcRH;实验动物生产许可证号:SCXK(京)200一0004号;实验动物使用许可证号:S}'XK(京)200一00042方法与结果　　本研究均参照GB/11}88}i}GB/T?4233一200的国家标准及中国药典2010年版二部方法进行。　　2.1细胞毒性试验评价本试验系将支架浸提液接触培养细胞，通过对细胞形态的观察及相对细胞增值率(RGR)的计算，评价供试品的体外细胞毒性作用。试验方法参照GB/T1s886.5的规定。并依据毒性分级标准(表1)评定试验组的毒性等级。　　试验结果见表2，试验组无细胞毒性现象，其细胞反应分级为0级，符合关于支架生物安全性的规定标准。　　2.2溶血性试验评价本试验是将支架与血液直接接触，通过测定红细胞破裂释放的血红蛋白量以判定供试品的体外溶血程度。试验方法参照GBiT14233.2一20的规定。评判标准:溶血率<5%时，可判断该材料不具溶血作用。试验结果见表3，支架的溶血率为}l，小于5%，没有发现该材料的溶血作用，符合生物材料溶血性试验的要求。　　2.3皮内刺激性试验评价本试验系将支架浸提液注人家兔皮内，以评价供试品在试验条件下对接触组织的潜在刺激性。试验方法参照GB/T16886.1(}的规定。分别在24,48和72h观察接触部位的反应情况，评定其结果并计分。试验结果见表4，连续观察3d，试验组及阴性对照组注射点及其周边组织均出现了一些水肿、红斑等细微的刺激反应，但与阴性对照组比较无明显差异。这主要与浸提介质植物油有关，油类液体在皮内注射中常会引发炎症反应。支架最后评定的结果为0.49分，小于标准要求:判定为皮内刺激试验阴性(刺激指数,1.0分)。　　2.4皮肤致敏试验评价本试验系采用支架浸提液与豚鼠皮肤接触，以评价供试品在试验条件下引发迟发型超敏反应的潜在性。试验方法参照c}iTm8s6.to的规定。试验经过皮内诱导、局部诱导和激发3步，去除敷贴物后24,48和7z观察，记录试验组和对照组动物激发部位皮肤反应情况，依据皮肤致敏标准对各组结果进行分级(表s>。敷贴试验结果表明，试验组与t照组比转t鼠的冷肤均无明显差异，没有发现该支架的皮肤致敏反应，符合标准规定。　　2.5急性全身毒性试验评价本试验系将支架浸提液注人小白鼠静脉内，在规定时间内观察小白鼠有无毒性反应和死亡情况，以判定供试品是否具有潜在的急性全身毒性作用。试验方法按照GB/T16886.11的规定。尾静脉注射(50mL·kg)，注射后4,24,48,72h观察小白鼠即时反应，观察试验动物的一般状态、毒性表现和死亡数量。结果显示试验组4,24,48,72h后，情况良好，活动、食欲正常，呼吸平稳，无中毒和死亡现象，与对照组无差异。　　试验组与对照组小鼠体重均略有增加，但无差异。说明在该试验条件下，该支架在静脉注射50mL·kg-’剂量范围内不具毒性反应，符合标准规定的要求。　　2.6热原性试验评价本试验系将支架浸提液注人家兔静脉，在规定的时间内观察家兔体温升高的J清况，以判定供试品是否具有潜在的材料致热作用。　　试验方法参照药典2010年版中国药典二部方法规定，试验结果见表6，结果显示3只家兔的升温幅度均为0.1℃，均低于0.6℃，升温总和为0.3℃，低于1.3℃，符合标准的规定，未发现热原反应。　　3讨论　　在支架表面涂层研究领域，功能性的生物活性涂层研究是近年来的热点，并取得了许多突破性的研究成果。本文研究的涂覆CD34抗体层的药物洗脱冠脉支架与目前已上市的DES明显不同，表现在该支架不仅具有DES的基本性能，还具有加速再内皮化的优势，即在药物涂层外构建了CD34抗体层。　　CD34抗体层由竣甲基葡聚糖与CD34抗体通过共价结合的方式形成，能够与循环血液中的CD34+细胞特异性结合，通过免疫反应原理捕获血液循环中的内皮细胞、内皮祖细胞，使损伤部位内皮细胞及内皮祖细胞密度增加，从而加速内皮组织修复过程。这种涂层设计将DES与内皮化支架的优势相结合并形成互补，以期达到既抑制内膜增生又加速内皮修复的作用。　　此外，该支架的可生物降解高分子载体是嵌段共聚物，该载体降解后的主要产物COz及HZ0，能随体内三梭酸循环排除体外，不会对机体产生有毒作用。聚合物中的聚乙二醇是一种用途极为广泛的聚醚高分子化合物，在新型生物材料的合成和改性中，聚乙二醇作为材料的一部分，将赋予材料新的特性和功能，如亲水性、柔性、抗凝血性、抗巨噬细胞吞噬性等。这些特性和功能使得该嵌段共聚物作为支架药物载体时具有更大的优势。　　药物洗脱冠脉支架不仅要具有与机体组织或器官相匹配的物理化学特性和生物力学性能，更应具有良好的生物相容性，以确保其在临床应用的安全。　　本研究通过细胞毒性试验、溶血性试验、皮内刺激试验、皮肤致敏试验、急性全身毒性试验及热原试验来评价该支架的生物相容性。结果表明该支架没有细胞毒性，无溶血现象，未对周围组织产生不良刺激和异物反应，不存在潜在的致敏性物质，具有良好的细胞相容性、血液相容性、组织相容性。说明利用该嵌段共聚物作为药物载体及在支架外构建CD34抗体涂层对该支架的生物相容性无明显影响，该支架可望成为一种新型冠脉药物洗脱支架应用于临床。　　参考文献1 Serruys PW,de Jaegere P,Kiemeneij F,et al.A comparison of balloon-expandable-stent implantation with balloon angioplasty in patients with coronary artery disease.New Engl J Med,1994,331(8):4892 Fischman DL,Leon MB,Baim DS,et al.A randomized comparison of coronary-stent placement and balloon angioplasty in the treatment of coronary artery disease.New Engl J Med,1994,331(8):4963 Costa MA,Foley DP,Serruys PW.Restenosis:The Problem and How to Deal with It.Practical Interventional Cardiology,London:Informa Healthcare,2002.2794 Nikol S,Huehns TY,Hofling B.Molecular biology and post-angioplasty restenosis.Atherosclerosis,1996,123(1):175 Sousa JE,Serruys PW,Costa MA.New frontiers in cardiology drug-eluting stents:Part Ⅰ.Circulation,2003,107:22746 Sousa JE,Serruys PW,Costa MA.New frontiers in cardiology drug-eluting stents:Part Ⅱ.Circulation,2003,107:23837 Babapulle MN,Eisenberg MJ.Coated stents for the prevention of restenosis:Part I. Circulation,2002,106:2734