组织工程支架材料聚乙醇酸的体外细胞贴壁性和降解性能研究

　　组织工程学体外构建组织的根本方法是将细胞与支架材料复合，使细胞在支架材料上增殖、分化，制备出有生物活性的组织或器官，用于临床替代病变组织或器官。对于细胞来讲，贴壁到一个合适的基质表面才能实现增殖和分化，组织工程支架材料正是为细胞提供了贴壁表面和三维环境。支架材料的细胞相容性是指支架材料能够使细胞在其表面贴壁，并提供一个良好的三维环境，支持细胞的增殖、分化，支持细胞发挥正常功能的特性川。组织工程支架是构建组织工程产品的结构基础，与细胞的直接结合是支架的最基本特征，必须具备良好的细胞相容性。针对应用于不同组织的修复，组织工程支架材料的形态和孔径大小也不同，支架材料的所有的设计都是为了服务于支持细胞的特定分化和功能的发挥，服务于组织修复和替代[2]。细胞在不同形态的支架上，生长状态也是各不相同的。所以，能用作组织工程支架材料的材料必须具备良好的细胞贴壁性。　　此外，降解性质也是组织工程支架材料的重要特性。在组织工程的理念出现以前，可用于临床的功能材料一般为非降解性材料，仅起到支撑固定的作用，但是此种非降解材料存在的一个问题是必须进行第2次手术取出这种材料，例如骨折后用于骨支撑的各种材料，如骨板和骨钉。而组织工程产品的理念是既给组织损伤及组织缺损部位的细胞提供三维生长空间，其本身具有生物活性，可诱导细胞分化生长和血管的长人，以形成活的自体组织，也能在组织修复的过程中逐渐降解，从而为新生组织让出空间，组织修复完成后，组织工程材料也降解殆尽。　　从而避免了二次手术的问题。聚乙醇酸由乙交醋(经乙酸的环化二聚体)经开环聚合而成，目前，已被美国FDA批准用于生物支架材料。PGA制成的纤维材料可用于骨组织工程,神经组织工程，引导骨和神经再生。本研究通过实验观察了这种组织工程支架材料的细胞贴壁性和体外降解性能。　　1仪器与试药　　CO2培养箱(Thermo)，倒置显微镜(Nikon)，扫描电子显微镜检测(Hitachi)oPGA纤维材料(上海国睿生命科技有限公司);L929细胞(协和医院细胞库);DMEM细胞培养基(M&CGene);胰酶(HYCLONE);PBS(M&CGene);胎牛血清(Gibco)，细胞培养用青霉素/链霉素双抗(CeZlgro)，二甲基亚矾(MPBIO),PBS缓冲液(吉诺生物)。　　2细胞培养　　复苏L929细胞，用含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM培养基进行传代培养，收集细胞，离心(1000:·min，5min)，对细胞进行计数，通过补加细胞培养基，将细胞浓度调整至试验所需浓度。　　3细胞毒性检测　　PGA纤维材料浸提液制备:取PGA纤维材料，按照每0.2gPGA纤维材料加1mL细胞培养基的比例制备浸提液，浸提介质为DMEM细胞培养基，37℃浸提24h，浸提液用于L929细胞增殖试验。　　用已知无细胞毒性的高密度聚乙烯作为阴性对照，用含20%(体积比)二甲基亚矾的DMEM培养基作为阳性对照。结果表明，PGA支架材料浸提液不影响L929细胞的正常增殖，与阴性对照相比，无显著差别，不影响细胞的正常增殖。　　4材料的细胞贴壁性试验　　进行细胞贴壁性试验前，对PGA材料进行压制，使之成为直径为9mm的圆片状，便于接种细胞。称取纤维材料20mg，放人直径为9mm圆柱形模具内，滴人无水乙醇1mL,70℃进行压制。　　隔夜后取出，放人75%酒精内浸泡1h，然后移至另一培养皿中继续在75%酒精内浸泡1h，取出材料，吸出多余液体，浸人预先准备好的培养液里，过夜，备用。将压制好的PGA圆片置于六孔细胞培养板中，将细胞按2x10，个·mg的密度接种到纤维支架材料上，将复合物于370C,5%CO2的二氧化碳培养箱中放置6h后，移至六孔板的一个未使用的孔中，加入培养液，在原孔中加入0.25%胰酶1mL消化3min，离心收集细胞(1000rmin,5min)，用血球计数板对细胞进行计数，得出流失的细胞数。对移人新孔中的PGA材料，沿六孔板孔壁加人培养液至没过样品上表面，轻微晃动，将材料取出。吸取孔中培养液并离心收集细胞，得到未粘附的细胞数。　　贴壁培养72h后，对细胞和PGA支架材料复合物进行逐级脱水，用电子扫描显微镜观察细胞在PGA支架材料上的贴壁状态。电镜观察前样品干燥方法:50%,75%,95%,100%乙醇梯度浓度脱水，每种脱水剂浸没5min。之后以乙醇一六甲基二硅胺烷按3:1,1:1,1:3的3种比例分别浸没10min,最后用六甲基二硅胺烷浸没10min。操作结束后去除孔内液体(不吸取材料中间的液体，以免影响材料上细胞)，自然风干。　　首先，用电子扫描显微镜观察细胞在PGA支架材料表面的贴壁状态。图1是用扫描电子显微镜观察到的PGA支架材料的微观图，PGA纤维直径约为20mm，与L929细胞的直径为1个数量级，且大于L929细胞的直径。PGA的20N.,m级直径使细胞能够在其表面贴壁。图1一B显示了L929细胞在PGA支架材料表面的贴壁态，可见L929细胞在PGA支架表面正常贴壁，贴壁密度较高。图1一C显示了贴壁在PGA支架材料表面的L929细胞形成了细胞连接。这说明细胞不但在PGA支架材料表面正常贴壁，贴壁后还正常进行细胞的生长和增殖，并正常分泌细胞外基质。以上扫描电镜的观察结果说明PGA支架材料为L929细胞提供了良好的贴壁表面，细胞可以在其表面贴壁并进行正常的细胞生命周期的活动。　　按照公式计算细胞粘附率:细胞豁附率=(接种的细胞数一流失的细胞数一未粘附的细胞数)/(接种的细胞数一流失的细胞数)x100%。接种细胞数为4x106个贴壁培养6h后，流失细胞数为2.1x104，未贴附的细胞数为9.6x104个，流失细胞数与未贴壁细胞数之和为掉落细胞总量，所以掉落细胞总量为2.1x1O4+9.6X104=1.17X10个。6h细胞粘附率为:(4x106一1.17X1O5)}(4X106一2.1x104)x100%=97.6%。　　5体外降解试验　　参照《GB/T16886.13一2001聚合物医疗器械的降解产物的定性与定量》部分设计试验方法。取PGA短纤维0.5g，浸人50mL降解液，以50mL离心管盛放。降解液为去离子水和PBS缓冲液(137mmol·L氯化钠，2.7mmol·L氯化钾，10mmol·L磷酸氢二钠，2mmol·L磷酸二氢钠，pH7.2，时间点设置为1周、2周、4周、6周、8周、10周、12周，每个时间点重复设3个样品，所有样品准备好后放人37℃烘箱(降解试验)和70℃烘箱(加速降解试验)开始实验。对pH进行检测:时间点到达后，取出样品。将pH计调零后测定降解体系pH并记录。　　对材料失重进行检测:时间点到达后，取出样品。对应样品数量取定性滤纸若干，并称重记录为m(滤纸重量)将降解产物及降解液倒人滤纸并过滤，之后放人烘箱真空干燥至恒重，取出称量并记录为M(滤纸及降解产物重量)，降解产物重量W=M一体外加速降解试验的降解温度为70℃，结果如图2所示。加速降解试验开始1d后，降解体系pH由7降至1，材料重量7d内由0.5g降解至0.1g。降解试验的降解温度为370C,12周后，材料由0.5g降解至0.1g(图3)。体外降解试验表明，PGA材料在水和磷酸盐缓冲液中具有可降解的性能，这提示PGA材料在生物体内具有良好的降解性能。　　6体内降解试验　　通过大鼠皮下包埋的方法观察PGA的体内降解表现。SD大鼠，分为对照组及包埋PGA组，共30只(SD大鼠购自中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所实验动物生产和供应室，体重为180-200g，雌雄各半)。无菌手术操作，将PGA1g包埋自大鼠皮下，背部左右各1块。分别在包埋后1周、2周、4周、8周、12周取材，进行病理切片，HE染色观察PGA降解的情况。图4-A,B,C,D分别显示了1周、4周、8周和12周的材料降解情况。包埋后1周，材料未见降解，取材时观察材料被纤维组织包裹，未见大量细胞浸润，炎症反应I级，纤维化I级;;4周后，材料大部分仍未降解，但是细胞浸润至材料内部.炎症反应I级，纤维化I级;;g周后，材料仍未完全降解，材料内部有细胞浸润，炎症反应I级，纤维化I级;12周后，材料基本完全降解，材料植人部位大部分已被新生组织所占据。取材时观察植人材料已基本降解吸收，切片HE观察植人部位可见疏松脂肪结缔组织中可见一囊腔，囊内几乎不可见植人材料，被大量吞噬细胞(含吞噬泡沫样物)和多核异物巨细胞、成纤维细胞充满，或仅留下中央部分为空腔，四周有坏死变性的细胞或降解物残渣。囊壁由纤维细胞和胶原纤维构成，个别切片有较多的淋巴细胞和多核异物巨细胞。炎症反应II一I}级，纤维化I级。可见，植人12周时，PGA材料基本降解吸收。以上体内降解试验表明，PGA材料在大鼠体内可正常降解。　　7讨论　　组织工程支架是组织工程产品的结构基础。其最根本的特征是与活体细胞直接结合。能用作组织工程支架的材料种类繁多，既有高分子材料也有生物材料。例如在骨组织工程中，与成骨细胞结合的聚乳酸经基乙酸(PLGA)支架,聚乳酸(PLA)支架、胶原蛋白支架，等;在神经组织工程中，与神经细胞结合的脱细胞同种异体神经支架材料，丝状胶原蛋白材料等;在角膜组织工程中与角膜细胞结合的胶原蛋白支架等;在软骨组织工程中，与软骨细胞结合的PLGA,PLA,聚乙酸纤维素(PGA)等。这些可作为组织工程支架材料的材料各自的来源、化学特性、力学性质各不相同，但是都必须具有良好的细胞相容性和降解性。　　本研究以PGA材料为例，设计试验方法，对其细胞相容性和降解性能进行了考察。材料细胞相容性的的考察是通过将细胞与材料同培养后，用电子显微镜观察细胞的形态来实现的;降解性能分为体外降解试验和体内降解试验，分别在体外水或PBS介质下对材料的降解特性和包埋至大鼠皮下之后的降解特性进行了研究。试验结果表明，用细胞和材料共培养的方式可以很直观地观察细胞在材料上的生长状态;体外和体内降解试验也适合用来考察材料的降解特性。PGA对细胞有良好的相容性，在体外和体内都能正常降解，是现阶段很适合用作组织工程支架的材料。　　组织工程学发展至今，已经有20多年的时间，积累了大量的研究成果，这些研究成果具有巨大的临床应用前景，能够为人类的健康造福。但是，由于现阶段针对组织工程产品的检测技术缺乏，使这些成果的市场化困难重重。对于组织工程产品的检测，不能采用传统的医疗器械生物医用材料的检测标准和检测方法，而应该研究针对组织工程产品的检测方法，使好产品能够在测试中表现出它的有效性，同时让不合格的产品露出破绽。这个工作的意义就是有针对性的设计试验方案对组织工程支架的2个重要特性(细胞相容性和降解特性)进行了初步研究，为组织工程支架的质量控制提供了检测依据。　　参考文献1 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