UPLC-MS/MS法同时测定灯盏生脉胶囊中的11个活性成分的含量

　　灯盏生脉胶囊是由灯盏细辛、人参、五味子和麦冬四味中药材及其他辅料经加工制成，具有益气养阴、活血健脑的功效。用于气阴两虚、疲阻脑络引起的胸痹心痛、中风后遗症，症见痴呆、健忘、手足麻木症、冠心病心绞痛、缺血性心脑血管疾病，高脂血症见上述证候者。现代研究表明，灯盏细辛中的灯盏花乙素具有扩张脑血管的作用，能降低脑血管阻力，增加脑血流量，改善微循环，并有对抗血小板聚集的作用,酚酸类化合物对溶血磷脂酞胆碱引起的脑微血管内皮细胞损伤有明显的保护作用;人参列为我国名贵药材之首，人参皂昔是其特征活性组分，主要表现在其对免疫系统、中枢系统、心脑血管系统及抗肿瘤等影响及调节[4]五味子为木兰科五味子属和南五味子属植物的泛称，其主要成分是木脂素类，除在中枢神经系统方面能起到有效的镇静、镇痛、催眠等功效外，其在保护肝脏、抗衰老及心血管疾病等方面也有显著作用[5];麦冬为百合科植物麦冬的干燥块根，<C<体皂昔类为麦冬主要化学成分，具有抗心肌缺血、抗血栓形成、耐缺氧、抗衰老、降血糖等多种药效功能。　　在质量控制研究方面，灯盏细辛、人参、五味子和麦冬四味中药材或是复方制剂都以上述活性成分作为检测指标「7-13]，其中麦冬皂昔D更是作为指标成分用来区别中药材浙麦冬、川麦冬和山麦冬。在2010年版中国药典中，灯盏生脉胶囊以野黄芬昔(灯盏花乙素)和4,5一二一咖啡奎宁酸作为定量指标;也有文献测定了灯盏生脉胶囊的咖啡酸\4，5一二一咖啡奎宁酸[16]、人参皂昔Rg，和人参皂普Rb,"伙野黄芬昔。本文建立了同时测定灯盏生脉胶囊中11个药效成分含量的超高效液相色谱一串联质谱(UPLC-MS/MS)的联用分析方法，方法准确，简便快速，已成功地用于实际样品的分析。　　1仪器、试剂与试药　　Agilent1290UPLC一6460TripleQuadLC/MS(美国，Agilent公司);EppendorfCentrifuge58108台式高速冷冻离心机(德国，Eppendorf公司);Synthe-sisAlOTM超纯水系统(美国，Millipore公司);ME2155电子天平(德国，Sartorius公司);KQ2200DV型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。　　甲醇、乙睛(色谱纯，Fisher公司);甲酸(分析纯，广东光华化学厂有限公司);乙酸钠(分析纯，广东光华化学厂有限公司)，实验用水为超纯水。对照品绿原酸、咖啡酸、人参皂昔Rg,，人参皂昔Rb,(中国食品药品检定研究院);人参皂昔Re,麦冬皂昔D、灯盏花乙素、五味子醋甲、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素(四川省维克奇生物科技有限公司)。样品灯盏生脉胶囊为市售品，云南生物谷灯盏花药业有限公司生产，批号分别为20110611,20110810,20111106。　　2溶液制备　　2.1对照品储备液准确称取含绿原酸、咖啡酸、灯盏花乙素、人参皂营Rg,、人参皂昔Re、人参皂营Rb,、五味子醇甲、麦冬皂昔D、五味子醋甲、五味子甲素、五味子乙素的对照品各10.0mg，分别用甲醇溶解并定容至10mL量瓶中，配成1.00mg·mL‘储备液，于4℃下保存，使用前用甲醇稀释到所需的浓度。　　2.2供试品溶液取本品数粒，倾出内容物，研碎，混匀，精密称取0.200g后置于具塞锥形瓶中，加85%甲醇水溶液45mL超声(功率100W，频率40kHz)30min，静置，放冷，以4000r·min一‘于4℃离心15min后将上层清液转移至50mL量瓶中，并用85%甲醇水溶液定容至刻度。经0.22}..},m微孔滤膜过滤后作为供试品溶液。　　3质谱条件　　离子源为电喷雾电离源，采用正、负离子模式交换检测，雾化气体:NZ,雾化器压力为2.8x105Pa;于燥气体:Nz，温度为350℃，流速为10L·min一‘;鞘气气体:Nz，温度为360℃，流速为12L·min;喷嘴电压为OV，毛细管电压为4kV。采用多重反应监测模式(MRM),11个化合物的质谱分析条件参数见表1。　　4色谱条件　　采用AgilentZORBAXRRHDEclipsePlusC,$色谱柱(2.1mmx50mm,1.8m);以含0.15%甲酸水溶液(A)一乙睛(B)为流动相，梯度洗脱5min,10%X18%40%->70%B;5一20min,l$%->20%B;20.1一30min，B);流速为0.35mL·min;进样量:1μL在选定的色谱质谱条件下，被测组分间可获得良好的分离，色谱图见图1.　　5方法与结果　　5.1线性关系及检出限取各对照品储备液，精确配制一系列不同浓度的混合标准溶液，重复进样测定3次，以各物质特征碎片离子峰面积平均值(Y)对被测组分的质量浓度(X,mg}L-')进行线性回归，得到回归方程、相关系数和线性范围及定量限。分别以信噪比(SlN)等于3和10为标准，测得11个待测组分的检出限和定量限，见表2.　　5.2精密度和稳定性试验　　取同一批次样品6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在优化的实验条件下测定，测定峰面积，结果显示各组分峰面积的RSD为0.64%-2.8%，表明该方法有较好的精密度。　　取同一批次样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在优化后的实验条件下，分别于0,2,4,6,8,10h进样测定，结果显示11个组分含量的RSD为0.62%一2.7%，表明供试品溶液在10h内稳定。　　5.3回收率试验精密称取已知绿原酸、咖啡酸、灯盏花乙素、人参皂昔Rg,、人参皂昔Re、人参皂昔Rb1、五味子醇甲、麦冬皂昔D、五味子酷甲、五味子甲素和五味子乙素含量的同批灯盏生脉胶囊样品0.200g共9份，3份为一组，分别加人精密称定的低、中、高3个质量的混合对照品。按“2.2”项下方法制备供试溶液进行测定，分别计算11个成分的平均回收率，结果见表3。本方法在3个浓度添加水平下，11个成分的加样回收率为%.5%一1O5%,RSD均小于3.0%，能满足灯盏生脉胶囊中11个有效成分的测定要求。　　5.4样品含量测定分别精密称取不同批号的样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述优化好的条件进行样品测定，把各组分峰面积代人回归方程计算得到样品中11个组分的含量，结果见表4.　　6讨论　　6.1样品提取方法的考察本文参照2010年版中国药典灯盏生脉胶囊项下条件，考察了提取溶剂(超纯水、30%甲醇水溶液，50%甲醇水溶液，85%甲醇水溶液，100%甲醇)，超声提取时间(0,10,30,45,60min)。实验结果表明，最终确定的“2.2项”下供试品溶液的制备方法为最优方法。　　6.2色谱条件的考察对常用流动相甲醇一水和乙睛一水进行了考察，实验结果表明使用乙睛一水体系作为流动相时灵敏度高于甲醇一水体系，色谱峰形对称，且分离效果更好。考察了在水中加人甲酸(0.0%，0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%，0.3%)对分离及灵敏度的影响。流动相中不添加甲酸时，绿原酸和咖啡酸2个物质峰严重拖尾，未能达到基线分离，且同时发现添加的甲酸的浓度会影响各组分的检测灵敏度。人参皂昔Rg}、人参皂昔Re、人参皂昔Rb，及五味子醋甲在流动相中未加人Na‘时的质谱特征离子显示为m/z[M十Na〕+峰，电离强度均不高。为提高m/z「M+Na」十峰的检测灵敏度，本文考察了在流动相中加人浓度为0,0.05,0.1,0.15,0.2mmol·L的醋酸钠，人参皂昔Rgl、人参皂昔Re、人参皂昔Rb，的离子强度有稍微提高，但是五味子酷甲及其他成分的离子强度有显著的下降。因此，本方法采用在流动相中加人0.巧%甲酸的乙睛一水为流动相进行梯度洗脱。　　6.3质谱条件的考察分别对比了正离子和负离子检测模式，发现在实验条件下，绿原酸和咖啡酸2个物质在负离子模式下检测灵敏度较高;灯盏花乙素、人参皂昔Rg,、人参皂昔Re、人参皂昔Rb,、五味子醇甲、麦冬皂昔D、五味子醋甲、五味子甲素、五味子乙素在正离子模式下检测灵敏度较高。因而，本实验采用正、负离子模式切换检测，采用MRM模式，以不同的碰撞能量将待测物的准分子离子打碎，以子离子响应最强来确定碰撞能量和源内碎裂电压。　　6.4本研究采用了UPLC一MS/MS联用技术，对中药复方制剂灯盏生脉胶囊中的成分进行定量分析。复方制剂中成分复杂，且含量高低不等，本实验选用质谱检测器，采用多重反应监测模式，质谱检测器的定性能力强、灵敏度高、线性范围宽保证了定性分析的可靠性和检测结果的准确性;UPLC法与常用HPLC法相比，具有分析速度快，节省溶剂和分离效率高的优点.　　6.5小结中药复方是多成分共同发挥药效作用的，单一成分的含量不足以用来衡量其质量。本文建立了UPLC一MS/MS同时测定灯盏生脉胶囊中绿原酸、咖啡酸、灯盏花乙素、人参皂昔Rg,、人参皂昔Re、人参皂普Rb,、五味子醇甲、麦冬皂昔D、五味子酷甲、五味子甲素、五味子乙素等11个药效成分含量的分析方法。实验结果表明，该方法具有简便、快捷、准确、灵敏和定性能力强的特点，已成功用于灯盏生脉胶囊中上述11个活性成分含量的同时测定，可以为灯盏生脉胶囊的质量控制和药物疗效、药代动力学等相关研究提供新的参考方法。　　参考文献1 ChP(中国药典).2010.Vol Ⅰ(一部):7062 ZHANG Xiao-li(张晓莉), LIU Si-hai(刘四海), ZHOU Fang(周芳), et al.Study advancement about pharmacological actions of Erigeron breviscapus(Vant.-Mazz.灯盏花的药理活性研究).Sichuan J Physiol Sci(四川生理科学杂志),2008,30(2):753 ZHANG Wei-dong(张卫东),HA.Thi Bang Tam,CHEN Wan-sheng(陈万生), et al.Study on the structure and activity of new phenolic acid compounds from Erigeron breviscapus(灯盏花中新的酚酸类化合物的结构及活性研究).Acta Pharm Sin (药学学报),2001,36(5):3604 LI Yang(黎阳),ZHANG Tie-jun(张铁军),LIU Su-xiang(刘素香), et al.Ginseng chemical composition and pharmacological research(人参化学成分和药理研究进展).Chin Tradit Herb Drugs(中草药),2009,40(1):1645 DU Guo-cheng(杜国成).Schisandra chemical composition and pharmacological research (五味子化学成分及药理研究进展).China Med Pharm(中国医药科学),2011,1(20):326 LIN Xiao(林晓),ZHOU Qiang-feng(周强峰),XU De-sheng(徐德生).Research progress of the pharmacological actions of ophiopogon root(麦冬药理性作用研究进展).Shanghai J Tradit Chin Med(上海中医药杂志),2004,38(6):59