利奈唑胺主要降解产物的结构鉴定

　　利奈唑胺为全合成的噁唑烷酮类抗菌药，化学名为(S)一N一{[3一(3一氟一4一(4-吗啉基)苯基)一2一氧代一5一噁唑烷基」甲基{乙酞胺，其结构见图1。利奈哩胺对革兰阳性球菌特别是多重耐药的革兰阳性球菌有良好的抗菌活性，对葡萄球菌、链球菌(包括肠球菌)敏感。由于利奈哩胺具有独特的作用位点和方式，不易与其他抗菌药产生交叉耐药性，在临床上用于革兰阳性菌引起的肺炎、皮肤软组织感染、脑膜炎、心内膜炎、菌血症、骨髓炎和外科手术感染等的治疗[Zl。本品疗效确切，应用广泛，但有不良反应的报道，主要表现为恶心、腹胀、腹泻、血小板减少等。　　利奈哩胺在存放过程中可能产生降解产物，　　为了分析利奈哩胺中的潜在杂质，保证药品的质量，对利奈A}进行了降解试验，分析鉴定了主要降解产物。有文献对利奈哇胺及其热降解产物进行核磁共振分析，但未介绍其他途径降解产物〔4〕。　　有文献报道采用TLC,HPTLC或HPLC法检查原料或制剂中的利奈哇胺及其降解产物。另有对利奈哩胺合成过程中杂质进行分离鉴定的报道〔9〕。本文对利奈A}}胺原料药进行水解、酸水解、碱水解、氧化、高温、强光破坏，取破坏试验样品进行HPLC分析，对主要的降解产物进行结构鉴定，并利用合成所得杂质对照品对降解产物进行了结构确证。本工作为利奈哩胺的稳定性和纯度控制提供了重要依据。　　1仪器与试药　　日本岛津LC一lOAT分析型高效液相色谱仪，SPD一10Avp紫外检测器，Class一VP色谱工作站;WatersAcquity超高效液相色谱仪，WatersQuattroPremierXE质谱仪;美国VarianINOVA400MHz核磁共振仪。利奈哩胺原料药、利奈哇胺杂质对照品(四川大学华西药学院药物化学系提供)，乙睛、三氟乙酸、甲酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯。　　2方法与结果　　2.1色谱条件采用HPLC法分析利奈哩胺强力破坏试验的样品。色谱条件如下:色谱柱为GeminiC,8柱(150mmx4.6mm,5N.,m;流动相:A相为0.1%三氟醋酸水溶液，B相为0.1%三氟醋酸乙睛溶液，按表1进行线性梯度洗脱;检测波长:254nm;流速:1.0mL·min。　　2.2强力破坏试验　　水解:取利奈哇胺原料药约25mg，置25mL量瓶中，加人水5mL，水浴加热1h，取出放冷，再加10%乙睛溶液溶解并稀释至刻度，摇匀;酸水解:取利奈哩胺原料药约25mg，置25mL量瓶中，加人1mol·L盐酸溶液5mL，放置过夜，加人1mol·L氢氧化钠溶液5mL中和，加10%乙睛溶液溶解并稀释至刻度，摇匀;碱水解:取利奈哇胺原料药约25mg，置25mL量瓶中，加人1mol·L氢氧化钠溶液5mL,85℃水浴加热5min，放冷，加人1mol·L盐酸溶液5mL中和，加10%乙睛溶液溶解并稀释至刻度，摇匀;氧化破坏:取利奈哩胺原料药约25mg，置2SmL量瓶中，加人30%HzOz溶液3mL，摇匀，放置过夜后，强烈振摇至无气泡产生，再加10%乙睛溶液溶解并稀释至刻度，摇匀;高温破坏:取利奈哇胺原料药适量，置烘箱中，于130℃加热3h后，取出，放冷，称取2Smg，置2SmL量瓶中，加10%乙睛溶液溶解并稀释至刻度，摇匀;强光破坏:　　取利奈挫胺原料药适量，用强光(4500lx士S00lx)照射Sd后，取出，称取2Smg，置2SmL量瓶中，加10%乙睛溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。　　取以上强力破坏试验的样品溶液，用“2.1”项下的色谱条件进行分析。结果表明，利奈哩胺的降解产物主要有3个，按保留时间先后顺序将降解产物命名为杂质1、杂质2和杂质3，降解产物及主成分相对含量见表2。利奈哩胺原料及酸、碱破坏样品的色谱图见图2.　　试验结果表明，水解、酸水解、碱水解、氧化等均可使有关物质的含量增加。其中酸水解和碱水解影响较为显著，在碱性条件下水解，利奈哇胺主要产生杂质1和杂质2，而在酸性条件下水解，则主要产生杂质3。利奈挫胺是嗯}}烷酮类化合物，分子中有醋键和酞胺键，易发生水解反应，在不同的条件下，其水解产物不尽相同。为了进一步研究3个主要降解产物的结构，运用LC一MS对其结构进行了鉴定。　　2.3杂质的鉴定　　2.3.1LC一MS分析供试溶液的制备:取“2.2”项下酸、碱破坏的样品溶液各适量，混合，即得。　　色谱条件:色谱柱为WatersAcquityUPLCBEHCis柱(100mmx2.1mm,1.7}A,m);流动相:A相为0.1%甲酸水溶液，B相为乙睛，按表3进行线性梯度洗脱;检测波长:254nm;流速0.25mL·min;进样:5μL.　　质谱条件:离子源:电喷雾离子源Esl;扫描方式:正离子扫描;扫描范围:miZ200--800;毛细管电压:2.8kV;锥孔电压:20V;萃取锥孔电压:5V;干燥气流速:600L·h;锥孔气流速:40L·h;离子源温度:100℃;干燥气温度:250℃。　　将制备所得的供试溶液进行LC一MS分析，总离子流图见图3，杂质1一3的质谱图见图4.　　从图3可以看出，杂质1、杂质2和杂质3的保留时间分别为1.72,3.24和3.90min。　　根据图4一A，杂质1的准分子离子峰[M+H〕十为m/z270.15。结合利奈哇胺的结构及降解的途径，推测杂质1为利奈哇胺分子中2个酞胺键及1个醋键均断裂的降解产物(称为全水解物，分子式为CmHzoFN3}z，准确质量为269.1540)，其结构见图5。　　根据图4一B，杂质2的准分子离子峰「M+Hj+为m/z312.17。结合利奈噢胺的结构及降解的途径，推测杂质2为利奈哩胺分子中A,}哇烷环酞胺键和醋键断裂的产物(称为开环水解物，分子式为CisHzzF1\303，准确质量为311.1645)，其结构见图6。　　根据图4一C，杂质3的准分子离子峰〔M+H」为m/z296.17。结合利奈哩胺的结构及降解的途径，推测杂质3为利奈P}}胺链状酞胺键断裂形成的产物(称为氨基物，分子式为C}aHisFNs}s，准确质量295.1332),氨基物也是利奈哩胺合成过程的中间体，其结构见图7}　　2.3.2与合成的杂质对照品比较为进一步确认以上的杂质，根据推断的结构，合成了杂质玖杂质2和杂质3。采用高效液相色谱法检查其纯度，均在98%以上。　　以DMSO一d6为溶剂，TMS作内标，分别测定了化学合成的杂质1、杂质2、杂质3的’HNMR和‘'CNMR.根据核磁共振分析的结果，再结合质谱、红外光谱、紫外光谱的分析结果，确定化学合成的3个杂质确为推断的结构。　　为了对3个降解产物的结构进行确证，将化学合成的3个杂质作为对照品，通过高效液相色谱的保留时间对降解产物的结构进行确证。　　杂质对照品溶液的配制:分别取杂质1,杂质2和杂质3的对照品各约5mg，精密称定，置10mL量瓶中，加10%乙睛溶解并稀释至刻度，摇匀;杂质加样溶液:取以上配制的3个杂质对照品溶液各0.OSmL，与利奈哇胺降解产物溶液2mL混合，即得杂质加样溶液。分别取杂质对照品溶液、利奈A}}胺降解产物溶液和杂质加样溶液各10},L，注人液相色谱仪，记录色谱图(图8)。　　由图8可知，化学合成的杂质1、杂质2、杂质3与利奈噢胺降解产物1,2,3的保留时间一致，且杂质加样溶液色谱图中三杂质处均为单一的峰，证明利奈f}}胺降解产物的结构即为以上推断的结构。　　3小结　　本文通过对利奈哩胺中3个主要的降解产物进行LC一MS分析，并通过化学合成杂质对照品对降解产物进行结构确证，得出利奈哩胺的碱降解产物主要为全水解物和开环水解物，酸降解产物主要为氨基物。本文的研究结果可为利奈挫胺的生产及贮存条件的选择提供依据。　　致谢:感谢四川大学华西药学院邓勇教授提供利奈哇胺及杂质1,2,3的对照品，感谢四川大学生物治疗国家重点实验室汤明海教授在质谱方面提供的帮助。　　参考文献1 DENG Xue-e(邓雪娥).Linezolid(利奈唑胺).Chin J New Drugs(中国新药杂志),2001,10(11):8462 CUI Xiang-li(崔向丽),ZHAO Zhi-gang(赵志刚).Pharmacology and clinical evaluation of linezolid(新型唑烷酮类抗生素利奈唑胺). Chin J New Drugs(中国新药杂志),2008,17(6):5303 NAN Guang-ri(南光日),LI Dong(李冬).Clinical application of linezolid(利奈唑胺临床应用分析).Prac Pharm Clin Rem(实用药物与临床),2009,12(6):4034 Hadden CE,Bowman PB,Duholke WH,et al.A long rang 15N-NMR study of the oxazolidinone antibiotic Zyvox and the major thermal degradation products.J Heterocyclic Chem,2000,37:16235 Belawy LI.Stability-indicating methods for the determination of linezolid in the presence of its alkaline-induced degradation products.Talanta,2003,60(5):9456 Agrawal H,Mahadik KR,Paradkar AR,et al.Stability indicating HPTLC determination of linezolid as bulk drug and in pharmaceutical dosage form.Drug Dev Ind Pharm,2003,29(10):11197 Lopes C,Salgado H.Development of a validated stability indicating LC assay and stress degradation studies of linezolid in tablets.Chromatographia,2009,69:1298 Mohapatra S,Annapurna M,Ravi Kumar B,et al.Validated stability indicating RP-HPLC method for the estimation of linezolid in a pharmaceutical dosage form.J Liq Chromatogr R T,2011,34:21859 Krishna Reddy KV,Mahender Rao S,Om Reddy G,et al.Isolation and characterization of process-related impurities in linezolid. J Pharm Biomed Anal,2002,30(3):635