医用透明质酸钠凝胶的绝对分子量及其分布的测定方法研究

　　透明质酸(hyaluronicacid,HA)是一种由D一葡萄糖醛酸和N一乙酞氨基葡萄糖通过/3-(1-3)糖昔键连接而成的双糖重复结构单元组成的线性多糖。每个双糖单元通过月糖昔键与另一个双糖单元连接起来。透明质酸钠是透明质酸的钠盐型式，分子量为401，分子结构式如图1所示.　　医用透明质酸钠凝胶是由透明质酸的钠盐配制成的凝胶状溶液。医用透明质酸钠凝胶的主要组成成分包括:透明质酸钠、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠与注射用水。经研究发现，医用透明质酸钠凝胶的生物活性与其分子量及浓度有密切关系3一6，故应根据使用目的来选用合适的分子量及浓度范围。　　测定医用透明质酸钠凝胶中的透明质酸钠分子量大多使用戮度法和分子体积排阻色谱法(GPC)但是，戮度法获得的只是样品的相对分子质量，且受乌式粘度计内径和温度影响较大;而且，由于透明质酸钠特殊的粘弹性，不存在与其特性相同的标准样品，因此，只能用与透明质酸钠结构相近的多糖物质代替，这就造成分析的准确性较差，所以基于标准样品的GPC分析不适用于其表征。但是.多角度激光光散射仪与体积排阻色谱法联用(}VIALLS-GPC)，为绝对表征提供了一个理想平台，因为光散射测量不依赖于泵速、聚合物标准或分子构象。可以直接得到绝对分子量和分子大小所需的数据，适用于各种各样透明质酸钠产品的表征。　　目前来说，因为糖类化合物在正常紫外区范围内吸收较弱，透明质酸钠含量测定方法主要是通过降解后显色，根据光吸收测定其中葡萄糖醛酸或者氨基葡萄搪的含量来计算透明质酸钠的含量.　　这种方法操作比较复杂，条件苛刻，并且对于制剂中透明质酸钠的测定，某些辅料会干扰透明质酸钠的含量测定。董科云等曾用凝胶色谱法测定透明质酸钠的含量，此方法需要配置不同浓度的透明质酸钠标准对照品，以浓度及峰面积按最小二乘法进行线性回归，用外标法求得透明质酸钠的含量。但是，此方法依赖于透明质酸钠标准对照品，而且，透明质酸钠标准对照品的定值还是依靠MALLS-GPC。而MALLS一GPC法在测定分子量的同时，可根据透明质酸钠特有的do/d。和样品示差信号强度求得透明质酸钠含量。此法简单方便，并且可以与分子量的测定同步进行。　　1实验仪器与材料　　1.1仪器SIS泵(美国Waters公司),77251手动进样器(美国Waters公司),2414示差检测器(美国Waters公司)、柱温箱(美国Waters公司)、DAWI HELEOSIII8角度激光光散射检测器(美国Wvatt公司)、DM45变量程密度计.1.2材料聚乙二醇(PE-r。标准品厂头tr聚合物标准品公司，绝对分子量;医用透明质酸钠凝胶SH上海其胜，20m·mL);医用透明质酸钠凝胶SH一2(上海其胜，15m·mL);硝酸钠(分析纯，上海展云化工有限公司);叠氮化钠(分析纯，北京化学试剂公司)。　　2实验方法　　2.1色谱条件色谱柱:OhpakSB-806及OhpakSB一G保护柱;流动相:0.1mol·L-'硝酸钠(含0.02%叠氮化钠)，0.22p,m滤膜过滤;流速0.5mL·min;柱温:3℃.　　2.2样品溶液的配制本次实验选用了聚乙二醇(PEG)标准品及2批不同浓度的透明质酸钠样品进行试验，具体样品溶液配置见表1。为使样品高分子链充分展开，样品溶解后放置过夜(流动相的pH为6.339。　　3结果与讨论　　3.1色谱条件的选择　　实验条件的选择对色谱分析的精度和准确性影响很大。经最终优化，确定本文实验条件，在此实验条件下分析透明质酸钠样品，透明质酸钠光散射及示差信一号图谱如图2所示。由图2可以看出，在此条件下，}o。光散射(LS)和RI检测器所产生的峰具有相似的大小和形状，几乎完全重叠，这表明2种检测器间的延迟已被准确地确定。峰形很好，且无粘性指形现象产生。　　3.2绝对分子量及其分布的测量　　3.2.1方法的准确度MALLS一GPC法测定已知分子量的PFG标准品，将实测值与标示值比较，得出PEG标准品实测值与标示值的相对偏差分别为数均分子量(Mn)4.0%，重均分子量CMw)4.7%，分散度PD;0.5%。　　3.2.2方法的精密度取样品SH-1和SH-2,连续进样6次，记录绝对分子量11、值，其RSD(n二6)分别为0.44%和1.6%。　　3.3透明质酸钠含量的测定　　MALLS一GPC法在测定分子量的同时，可根据SH特有的dnldc和样品示差信号强度求得透明质酸钠含量。为验证方法的准确性，又用经典方法-糖醛酸含量法进行了测定，实验数据见表2.　　表2列出样品外包装标称浓度及MALLS一GPC法、糖醛酸含量法实测数据。从表2可以看出，MALLS一GPc法和糖醛酸含量法所得结果相差不大，均在样品标称含量可接受范围之内。　　MAILS一GPI法可以测得透明质酸钠含量的原理也很简单:do/d。值描述的是聚合物溶液折光指数相对于溶质浓度的变化。但是，dnldc随波长变化，所以必须在与光散射仪相同的波长下测量dnldc值。测定时只需将样品做一系列稀释，然后将这些稀溶液注人示差检测器中，通过软件自动收集数据。然后，该软件根据示差检测器的(do)信号强度和稀溶液浓度(do)计算dnldc值。同理，我们将待测样品的稀溶液注人系统中，仪器可自动根据do/dc值和样品示差信号强度得出样品的浓度。　　但是，dnldc值一般是单机测量。若联机测量　　样品需对已流出总质量作出许多假设。如色谱柱对样品没有吸收，样品的扩散不对最后总质量有影响等。本文没有对这些假设作进一步验证，将其当作进人联机测量样品全部流出，进人最终计算。　　3.4样品的分子结构特性的确定图3是医用透明质酸钠凝胶SH一1的分子量及均方根旋转半径(RMSradius)随保留时间变化的色谱图，由图计算可得到样品的分子结构特性，见表3.　　由表3可以看出，本文中的SH样品分散度接近于1，属于窄分布;分子量大于]100万，属于高分子量样品。所得的RMSradius与报道文献所得相近。　　GribbonP等〔报道在1mg·mL-‘的浓度下，透明质酸钠的RMSradius为135nm通过数据处理可以得到样品的均方根旋转半径，用均方根旋转半径对分子量hlw.作图，由直线的斜率可以获知分子的形状，如图40teenJ}13」等研究得出:当斜率为1左右，表示这个聚合物的聚集态为棒状，0.5一0.6则表示是无规线团，0.3左右则表示为球状。本实验所得斜率为0.62士0.00，表明医用透明质酸钠凝胶的分子是具有无规则线团构象的线性聚合物。在重结晶过程中，无规则线团不易充分伸展分离、趋向有序，而更易形成网状结构，进而使凝胶弹性与内聚性增强。　　4结论　　MALLS一GPC法测定分子量具有其独特的优点。不需要任何假设和标准物质进行校正，具有较高的准确性和精密度，其操作简单，可实现连续测定。本法在实验过程中可同时得到均方根旋转半径、聚集态及样品含量等信息，可用医用透明质酸钠凝胶的质量控制和应用研究。本法在测定样品中透明质酸钠含量时，所得结果与糖醛酸含量法相差不大，但方法简剿更捷。　　参考文献1 Surendrakumar K,Martyn G,Hodgers EC,et al.Sustained release of insulin from sodium hyaluronate based dry powder formulations after pulmonary delivery to Beagle dogs.J Control Rel,2003,91(3):3852 Laurent TC,Laurent UB,Fraser JR.The structure and function of hyaluronan:An overview.Immunol Cell Biol,1996,74(2):A13 Arshinoff SA.Dispersive and cohesive viscoelastic materials in phacoemulsification revisited.Ophthalmic Pract,1998,16(1):244 Goa KL,Benfield P.Hyaluronic acid:A review of its pharmacology and use as a surgical aid in ophthalmology,and its therapeutic potential in joint disease and wound-healing.Drugs,1994,47(3):5365 Laurent TC.The Chemistry Biology and Medical Applications of Hyaluronan and Its Derivatives.London:Portland Press,1998.2136 Morra M.Engineering of biomaterials surfaces by hyaluronan.Biomacromolecules,2005,6(3):12057 LI Guo-feng(李国凤),ZHANG Kai-jun(张凯军),CUI Xiang-zhen(崔向珍),et al.The sodium hyaluronate molecular weight comparison for different diameter with viscometer test(不同内径乌式粘度计检测透明质酸钠分子量的比较).Shandong Pharm Ind(山东医药工业),2003,22(6):448 EP 5.0.2004.24349 DONG Ke-yun(董科云),LUAN Yi-hong(栾贻宏),GUO Xue-ping(郭学平).Determination of the Content of Sodium Hyaluronic Acid by GPC(凝胶色谱法测定透明质酸钠的含量).Shandong Province Medicine in 2006 Biochemical and Biotech Drugs Proceedings(山东省药学会2006年生化与生物技术药物学术研讨会论文集),2006.13710 CHEN Zhong-you(陈重酉).Gel permeation chromatography analysis precision and accuracy(凝胶渗透色谱分析的精度和准确性).Chin J Chromatogr(色谱),1989,7(3):138 TE