2种HPLC-柱后衍生化-荧光检测法测定陈皮中黄曲霉毒素的比较

　　黄曲霉毒素(aflatoxins)被世界卫生组织的癌症研究机构(IARC)列为I类致癌物质n，是由真菌(fungi)，如黄色曲霉菌(Aspergillusflavus)和寄生的曲霉菌(A.parasiticus)产生的次级代谢产物。现在大约有十几种相关的黄曲霉代谢产物，但是目前只有黄曲霉毒素BBz,GGz在中药材中被发现，其中黄曲霉毒素B}毒性最强。中药材在采收、贮存、加工和炮制过程处理不当，容易滋生霉菌并被其产生的黄曲霉毒素所污染。因此，真菌毒素污染问题成为了中药材安全性的问题之一，受到国家和世界其他国家、组织的重视，分别制订了严格的限度值。　　文献资料研究表明，中药材的黄曲霉毒素检测方法有酶联免疫法(ELASA)}2一3伙薄层色谱法(TLC)4伙免疫亲和柱一荧光分光光度计法(SFB)r〕、免疫亲和柱一高效液相色L谱法(IAC一HPLC〕及液质联用法(HPLC一MS/MS)等。目前，免疫亲和柱(IAC)净化浓缩，HPLC一FLD检测iz-ISi，是中药材中黄曲霉毒素检测的常见方法。由于黄曲霉毒素B}和G:的荧光强度较黄曲霉毒素Bz和Gz弱，且在含水流动相中容易发生淬灭，检测时通常采用衍生化的方法提高检测灵敏度。常用的衍生化方法有柱前衍生化或柱后卤衍生化、柱后紫外光衍生化及柱后电化学衍生化的方法。中国药典2010年版一部共收载了陈皮、桃仁、酸枣仁、僵蚕和胖大海5味药材的黄曲霉毒素检测，附录中收载了通用的检测方法L，为高效液相色谱一柱后碘衍生化一荧光检测的方法。欧洲药典7.0版二的附录中也收载了植物药的通用黄曲霉毒素检测方法，其衍生方法分为(1)柱后过嗅化氢嗅化毗陡衍生化法(PBPB);(2)柱后光化学衍生化法(PHRED);(3)柱后电化学衍生法(KOBRA)。本文选取陈皮作为研究样品，采用优化的样品前处理方法提取样品，2种柱后衍生化(碘衍生化和电化学衍生化)一荧光检测器检测，分别对2种衍生化方法进行了验证和比较，结果2种衍生化方法的测定结果比较接近，表明电化学衍生法也适用于陈皮的黄曲霉毒素检测。　　1仪器与试剂、试药　　日本岛津公司LC一10AT高效液相色谱仪，RF一10AxL荧光检测器，CRB-6A衍生系统;常州国华电器有限公司SHA一B数字恒温振荡器;AflaTest@P，美国VICAM公司黄曲霉毒素免疫亲合柱(1mL)。黄曲霉毒素混合标准品溶液(美国SUPELCO公司，Lot;LB68262;黄曲霉毒素Gz,G},Bz,B;浓度分别为0.3,1.0,0.3,1.0g·mL)。甲醇、乙睛均为色谱纯，水为超纯水;吐温一20(光谱纯，SIGMA公司，P一5927);澳化钾(光谱纯，国药集团化学试剂有限公司，批号F20090928);硝酸(高纯，北京化工厂。样品自购，经辽宁省食品药品检验所中药室王维宁副主任药师鉴定为陈皮。　　2方法与结果　　2.1色谱条件色谱柱:DiamonsilODSC,g(5},m,4.6mmx200mm);柱温:30℃;荧光检测:激发波长360nm，发射波长450nm;进样量:20L。各色谱峰之间分离度均大于1.5.　　2.1.1柱后碘衍生化以甲醇一乙睛一水(25:18:57)为流动相，流速0.8mL·min;衍生溶液为0.OS%碘溶液(取碘0.5g，加人甲醇100mL使溶解，用水稀释定容至1000mL，即得)，流速0.3mL·min，衍生反应温度70℃。　　2.1.2柱后电化学衍生化以甲醇一乙睛一水(20:20:60)为流动相(每1L流动相中加人嗅化钾120mg和4mol·L硝酸350p.L)，流速1.0mL·min;电化学衍生池(KobraCell,R一BiopharmRhone，Glasgow，UK)。　　2.2供试品溶液的制备取陈皮样品粉末(过2号筛))5g，精密称定，加人氯化钠1g及70%甲醇75mL，振荡30min(速度180:·min)，静置30min后，滤过，精密吸取滤液10mL，用1%吐温一20稀释至50mL，摇匀，用微孔滤膜(0.45}..},m)滤过。取续滤液20mL，通过免疫亲合柱(流速3mL·min)，用水20mL洗脱(流速3mL·min)，洗脱液弃去，使空气进人柱子，将水挤出柱子，再用1.5mL甲醇洗脱(流速1mL"min-'，收集甲醇洗脱液，用水稀释至2mL，摇匀，即得。　　2.3标准曲线的制备精密量取黄曲霉毒素混合标准品溶液0.5mL，用甲醇稀释至10mL，作为混合标准品储备液。精密量取储备液1mL，用70%甲醇稀释至25mL，作为标准工作液。精密吸取标准工作液1,2,3,5,10,20,30,40,60p,L，注人液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积Y为纵坐标，进样量X}pg)为横坐标，绘制标准曲线。碘衍生化和电化学衍生化的色谱图见图1，回归方程及线性范围见表1。结果表明:柱后碘衍生化，黄曲霉毒素Gz,Bz在2}36pg范围内线性关系良好，黄曲霉毒素G,,Bi在2一120pg范围内线性关系良好;柱后电化学衍生化，黄曲霉毒素Gz,Bz在1.2一36pg范围内线性关系良好，黄曲霉毒素GBi在2一120pg范围内线性关系良好。　　2.4精密度试验取标准工作液(黄曲霉毒素Gz,Gi,Bz,B，浓度分别为0.6.2,0.6,2ng·mL)，连续进样6次，记录峰面积。碘衍生化，黄曲霉毒素Gz,GBz,B，峰面积的RSD分别为1.4%,0.67%、1.0%和0.54%;电化学衍生化，4个黄曲霉毒素峰面积的RSD分别为1.4%`0.58%,0.70%和0.43%。　　2.5稳定性试验精密称取样品粉末(过2号筛)精密加人“2.3”项下制备的混合标准品储备液0.5mL，按“2.2”项下方法制备供试溶液，于配制后氏3,6,8,12h进样分析。碘衍生化，黄曲霉毒素Gz,G1,Bz.Bi峰面积的RSD分别为1.2%,0.77%,0.98和0.44;电化学衍生化，4个黄曲霉毒素峰面积的RSD分别为1.1%,0.65%,0.$4%和0.33%。表明供试品溶液在12h内基本稳定。　　2.6重复性试验精密称取样品粉末(过2号筛)5g，共6份，分别精密加人混合标准品储备液0.5mL，按“2.2”项下方法制备供试溶液，进样测定。碘衍生化，黄曲霉毒素Gz,GBz,B，峰面积的RSD分别为2.7%,3.2%,3.4%和3.8%;电化学衍生化，4个黄曲霉毒素峰面积的RSD分别为1.6%,2.2%,3.3%和2.4%。表明重复性试验结果良好。　　2.7仪器的检测限倍比稀释标准工作液，进样分析，按信噪比3:1确定检测限。碘衍生化，黄曲霉毒素Gz,Gi,Bz,B,检测限分别为0.59,0.52,0.60,0.60pg;电化学衍生化，检测限分别为0.25,0.41,0.25,0.44pgo2.8方法的检测限取样品粉末Sg，精密称定，精密加人混合标准品储备液适量，依法制备供试溶液，进样测定，以信噪比为3:1计算检测限。碘衍生化，黄曲霉毒素Gz,Gi,Bz,B，检测限分别为0.24,0.21、0.19,0.22kg;电化学衍生化，检测限分别为0.15,0.15,0.10,0.18p,g·kg。　　2.9回收率试验取样品粉末5g(12份)，分别加人混合标准品储备液适量(2个浓度水平，添加量相当于0.5pig·kg和5.0g·kg)，依法测定，结果见表2oCodex}2规定，当添加浓度小于1g·kg时，回收率范围应为40%一120%;当浓度水平为1一10},g·kg-‘时，应为60%一115%。表明本法回收率试验结果良好。　　2.10样品测定精密吸取供试品溶液20},L，注人液相色谱仪，测定峰面积，由回归方程计算出样品中相当于黄曲霉毒素G2,GBz,B}的量，计算，即得。采用2种方法分别测定6批陈皮样品，均未检出黄曲霉毒素。　　3讨论　　3.1采用中国药典2010年版一部“陈皮”项下供试品溶液的制备方法试验，出现回收率偏低的现象。实验中对供试品溶液的制备方法进行了优化，考察了15mL和10mL提取液分别用水、FBA缓冲液、1%吐温一20稀释的试验结果。经过比较，将陈皮提取液的取用量由15mL改为10mL，稀释溶液由水改为1%吐温一20。本文采用优化后的方法制备供试品溶液，提高了黄曲霉毒素Gz,Gi,Bz,B}的回收率，特别是黄曲霉毒素Gz的回收率。　　3.2柱后碘衍生化采用了中国药典2010年版一部附录IXV黄曲霉毒素测定法中的色谱条件「‘6〕，以甲醇一乙睛一水(40:18:42)为流动相，根据分离结果，调整流动相比例，以甲醇一乙睛一水(25:18:57)的分离效果好，保留时间适中。柱后电化学衍生化化采用了欧洲药典6.0版附录2.8.18.草药中黄曲霉毒素B，测定法中的色谱条件23]，以甲醇一乙睛一水(20:30:60)为流动相，根据分离结果，调整流动相比例，以甲醇一乙睛一水(20:20:60)的分离效果好。　　3.32种衍生方法在线性范围、重复性、回收率等方面较相似。电化学衍生化法在检测限方面略优于碘衍生化法;此外，该方法操作简单、分析时间短，因此也适用于陈皮中黄曲霉毒素的检测。　　3.4碘衍生化法需要添加1个HPLC泵来输送衍生液，每天都需要配制腐蚀性的碘溶液，且需要在高温下长时间反应(会造成峰加宽)。电化学衍生化法与之相比，具有不需要每天配制衍生液，加人嗅化钾和硝酸的流动相很稳定，不需要接触卤素溶液，不需要添加泵，不会腐蚀仪器，成本低，大大提高黄曲霉毒素的荧光度值、常温下只需要4s即可完成衍生，不需要加热设备等优点。目前，中国药典采用了碘衍生化法和光化学衍生化法检测黄曲霉毒素，电化学衍生法尚未列人药典中。电化学衍生化法在欧美很多国家已经使用多年。欧洲药典6.0版(2008年)附录[23〕中，黄曲霉毒素的检测首次收载了该衍生化方法，成为欧洲药典的官方方法之一。电化学衍生化法在我国的应用还需做广泛的研究，方法成熟后建议收人中国药典。　　致谢:感谢中国食品药品检定研究院的金红宇老师、上海市食品药品检验所的郑荣老师、季申主任对此项研究工作给予的支持和帮助。　　参考文献1 IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans,some naturally occurring substances:food items and constituents,heterocyclic aromatic amines and mycotoxins,vol.56,World Health Organization International Agency for Research on Cancer,Lyon,1993.2452 LI Wen(李汶),ZHUANG Xue-cong(庄学聪).Determination of aflatoxin B1 in regular Chinese medicine by ELISA method(ELISA 法检测常用中药黄曲霉毒素B1).Chin Pharm Aff(中国药事),2000,14(2):1013 LI Yan-sheng(李延生),CHEN Jian-min(陈建民).Determination of aflatoxin B1 in traditional Chinese medicine by ELISA(ELISA试剂盒定量检测中药材和中成药的黄曲霉毒素B1).Chin Tradit Herb Drugs(中草药),2000,31(8):5864 LU Zhi-yan(卢志雁),YE Jin-wen(叶锦文),YUAN Wen-ping(苑文平),et al.Determination and analysis of aflatoxins in seven kinds of drugs(七种药物中黄曲霉毒素测定与分析).Stud J Tradit Chin Med(中医药学刊),2001,19(5):527