HPLC测定不同产地土茯苓中落新妇苷和黄杞苷含量

　　土获菩来源于百合科植物光叶被莫Smilax郭a-braRoxb.的干燥根茎，收载于中国药典2010年版，甘、淡，平。归肝、胃经;功能解毒，除湿，通利关节。用于梅毒及汞中毒所致的肢体拘挛，筋骨疼痛;湿热淋浊，带下，痈肿，凛病，疥癣。土获荃是广西特产双钱牌龟菩膏的重要组成部分。土获菩药材中含有一系列二氢黄酮昔类成分，其中落新妇昔和黄祀昔为其中所得量较大的成分。文献也表明二氢黄酮昔类成分具有抗炎、镇痛的活性成分。然而不同产地的土获菩药材中有效成分的含量存在一定的差异，同剂量药材由于有效成分含量的差异可能导致临床疗效和毒性的不确定性，从而影响临床安全用药，本研究采用HPLC法对不同产地土获菩药材进行了比较分析与评价，建立以落新妇昔和黄祀昔作为定量指标的测定方法，对建立土获菩药材质量标准并用于控制其质量有重要意义。　　1仪器与试药　　Waters2695高效液相色谱仪，Waters996二极管阵检测检测仪，Empower色谱工作站，十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(WatersSUNfireTMODS250mmx4.6mm,5mm);落新妇昔、黄祀昔的对照品为自制，归一化法纯度>98%;土获荃药材采自不同地区，经桂林医学院生药学教研室鉴定为土获荃SmilaxglabraRoxb.的干燥根茎。甲醇、乙睛(色谱纯);水(超纯;磷酸(分析纯)。　　2.方法与结果2方法与结果　　2.1混合对照品溶液的制备分别精密称取置五氧化二磷干燥器中干燥至恒重的落新妇昔、黄祀普对照品适量，加甲醇制成每1mL均含20g的混合溶液，即得。　　2.2供试品溶液的制备取本品粉末(过2号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人甲醇50mL，密塞，摇匀，称定重量，超声(功率250W，频率40kHz)提取45min，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。　　2.3色谱条件色谱柱:WatersSUNfireT"`ODS4.6mmx250mm,5Nm;流动相:甲醇一水一磷酸(35:65:0.1);流速:1.0mL·min,柱温;35℃;检测波长:290nm。在上述色谱条件下，对照品及样品的HPLC色谱图见图1.2.4线性关系的考察以甲醇制备含落新妇昔0.1020mg·mL,及黄祀昔0.1160mg·mL的混合对照品溶液。精密吸取上述混合溶液0.丘1,孰3,5mL，分别置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列浓度混合对照品溶液。吸取上述各溶液10L分别进样测定，记录落新妇昔和黄祀昔的峰面积，以进样量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，分别绘制标准曲线。落新妇昔、黄祀昔回归方程分别为:　　Y=2.238x106X一7.140x10`r=0.9997　　Y=1.693x106X+3.759x106r=0.9997　　落新妇昔进样量在0.051一1.02g的范围内、黄祀昔进样量在0.058一1.16g的范围内，分别与相应的峰面积呈现良好的线性关系。　　2.5精密度试验精密吸取同一批供试品溶液10L，连续进样6次，测定峰面积，落新妇昔和黄祀普峰面积的RSD分别为0.65%和0.30%。　　2.6稳定性试验精密吸取2008-07-03采自桂林市灵川县潭下镇的土获菩的供试品溶液10L,分别于1,3,6,12,18,24h内进样，测得落新妇昔、黄祀昔含量的RSD分别为1.5%和1.2%。结果表明供试品溶液在室温下放置24h内稳定。　　2.7重复性试验称取同一土获菩药材(采集时间2008一07一03)粉末(过2号筛)约0.5g共6份，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样10},L,测得落新妇昔和黄祀昔平均含量分别为0.26%和0.12%,RSD分别为0.39%和0.56%。　　2.8加样回收率精密称取已测知知含量的土获菩粉末9份(落新妇昔含量为0.26%，黄祀昔含量为0.12%，每份约0.25g，分别置具塞锥形瓶中，每3份一组，分别依次精密加人浓度为0.4438,0.5526,0.6582mg}mL-‘的落新妇昔对照品溶液各1.0mL以及浓度为0.2584,0.3205,0.3806mg·mL的黄祀昔对照品溶液各1.0mL;挥干甲醇，按"2.2”项下方法制备供试溶液，进样10L，测定含量并计算回收率。结果落新妇昔低、中、高浓度回收率(n=3)分别为99.94%,98.63%,99.30%,RSD分别为1.3%,0.51%,0.75%;平均回收率(n=9)为99.23%。黄祀昔低、中、高浓度回收率(n=3)分别为100.3%,99.40%,100.1%,RSD分别为0.52%,0.54%,0.78%;平均回收率(n=9)为99.93%。本法回收率良好，符合规定要求。　　2.9不同产地土获菩样品含量测定结果取不同产地土获菩药材样品各3份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样10L,测定峰面积，按外标法计算不同产地土获荃中落新妇昔和黄祀昔的含量，测定结果见表1.　　3讨论　　3.1采用高效液相色谱法同时测定了土获荃药材中落新妇昔和黄祀昔的含量，为土获菩这味民间习用药材质量控制提供了依据。不同产地土获荃中落新妇昔和黄祀昔的含量总和平均为0.48%以上，考虑到产地、贮存条件、取样均一性等因素的原因，含量限度宜下浮20%，故其含量总和限度宜设在0.}8%为宜。2010年版中国药典将土获菩的落新妇昔含量定为不得低于0.45070，可能在实际商品药材很难达到。　　3.2本检测方法操作简单，重复性好;色谱分离时，在流动相中加人适量的磷酸，能使相似组分有较好的峰形和分离度。考察0.0S%,0.10%和0.15%浓度的磷酸对含量测定影响，结果磷酸浓度在0.05%时，落新妇昔和黄祀营峰对称因子比磷酸浓度0.10%时差，考虑到酸度本身对0DS柱子的影响，选用磷酸浓度为0.10%较为适宜。曾尝试用乙睛-水一磷酸(15:85:0功这个流动相进行试验研究，由于其出峰时间较快，基线较为不平，对落新妇普和黄祀昔的含量测定有较大影响。　　3.3通过波长扫描，落新妇营和黄祀昔的最大吸收波长分别为292nm和290nm，很接近，故选择290nm作为测定波长。　　参考文献　　1 ChP(中国药典).2005.Vol Ⅰ(一部):17　　2 Zhang QF,Zhang ZR,Cheung HY.Antioxidant activity of Rhizoma Smilacis Glabrae extracts and its key constituent-astilbin.Food Chem,2009,115(1):2973 WANG De-jun(王德军),SHOU Qi-yang(寿旗扬),ZHOU Wei-min(周卫民),et al.Effect of Rhizoma Smilacis Glabrae on glucose metabolism and renal function in diabetic nephropathy rats(土茯苓对糖尿病肾病大鼠糖代谢及肾功能的影响).Chin Arch Tradit Chin Med(中华中医药学刊),2009,27(12):26624 Zhang QF,Cheung HY,Zeng LB.Development of HPLC fingerprint for species differentiation and quality assessment of Rhizoma Smilacis Glabrae.J Nat Med, 2013,67(1):2075 ZOU Jie-ming(邹节明).A Collection of Features Chinese Herbal Medicine Resources in Guangxi(广西特色中草药资源选编).Beijing(北京):Science Press(科学出版社),2010.897