珍菊降压片含量及均匀度测定方法研究
发表时间：2014-06-05 浏览次数：1285次
珍菊降压片为中西药复方制剂，主要组成成分为盐酸可乐定、氢氯噻嗪、芦丁、珍珠层粉及野菊花膏粉。在临床上具有较为平稳的降压效果，不良反应少。因此有比较好的市场需求。其中盐酸可乐定具有中枢降压作用，且其含量少，每片仅为30μg，但疗效作用强，因此建立其盐酸可乐定的含量及含量均匀度测定方法，控制珍菊降压片的产品质量非常重要。因此我们对珍菊降压片中盐酸可乐定含量均匀度测定方法进行了研究，并对此方法进行了专属性、线性、重复性、中间精密度、检测限、定量限、回收率、稳定性、耐用性等方面的方法学验证考察[1]，结果显示本方法操作简单，专属性、重复性、耐用性良好，可作为控制珍菊降压片中盐酸可乐定含量及均匀度的方法。具体实验内容如下：1 仪器与试药1.1 仪器高效液相色谱仪：Agilent1100配有四元梯度泵，UV检测器。1.2 试药盐酸可乐定对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100071-199905)，乙腈(色谱纯)，纯化水，其他试剂均为分析纯。2 方法考察2.1 色谱条件色谱柱：Diamonsil C18(200mm×4.6mm,5μm);流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾-乙腈(80：20);检测波长：210nm;柱温：35℃;流速：1.0 mL?min-1;进样量：20μl2.2 对照品、供试品溶液的制备2.2.1 对照品溶液的制备取盐酸可乐定对照品适量，精密称定，用流动相稀释成每1ml含盐酸可乐定3μg的对照品溶液。2.2.2 供试品溶液的制备[2]取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于1片量)，加0.01mol?L-1盐酸溶液25ml，超声20min，离心，精密移取上清液20ml，加0.1mol?L-1氢氧化钠溶液5ml，用二氯甲烷萃取3次，每次20ml，合并二氯甲烷液，置水浴上蒸至近干，残渣用流动相在水浴80℃溶解，并转移至10ml容量瓶中，放冷至室温，加流动相至刻度，摇匀，即得。2.3 系统适用性试验取供试品溶液，在上述色谱条件下测定，理论塔板数以盐酸可乐定计算不小于3000，主色谱峰与相邻峰之间分离度均大于1.5。2.4 专属性试验取不含盐酸可乐定的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法处理，照上述色谱条件，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果表明在与盐酸可乐定对照品相应的保留时间处无色谱峰，表明处方中其他原辅料对测定无干扰，本方法专属性良好。结果见图1-3。 图1 盐酸可乐定阴性空白图2 盐酸可乐定对照品 图3 珍菊降压片样品2.5 线性关系考察精密称取盐酸可乐定对照品10.41mg，置100ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取上述对照品储备液0.5ml,1.0ml,1.5ml,2.0ml,3.0ml,4.0ml，置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。照上述色谱条件，分别精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归，结果见表1。表1 线性关系测定结果表2 重复性测定结果2.7 中间精密度取同一批次样品，由两个分析人员在不同时间使用不同仪器和试剂，按供试品溶液制备方法分别配制6份相同浓度的供试品溶液，照上述色谱条件，精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。所得12个含量数据结果见表3。表3 中间精密度测定结果2.8 检测限将对照品溶液稀释至约3倍信噪比的浓度，该溶液浓度为0.016656μg/ml。因此确定该色谱条件下盐酸可乐定的检测限为0.016656μg/ml。2.9 定量限将对照品溶液稀释至约10倍信噪比的浓度，该溶液的浓度为0.056214μg/ml，重复进样6次，考察主峰保留时间和峰面积的相对标准偏差。结果见表4。表4 最低定量限浓度考察结果2.10 回收率试验采用空白加样回收试验法。分别称取9份不含盐酸可乐定的阴性样品约0.2800g，按低、中、高浓度分别精密加入对照品溶液(为减小误差，制成对照品甲醇溶液储备液)，挥去甲醇，自“加氨试液2ml”起按供试品溶液制备方法操作。照上述色谱条件，分别精密吸取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率。结果见表5。表5 回收率测定结果2.11 稳定性试验取同一供试品溶液(批号：20100323)，照上述色谱条件，分别于0、1、2、4、8、24h测定盐酸可乐定峰面积，考察样品稳定性。结果见表6。 表6 稳定性测定结果2.12 耐用性[1]我们分别考察了流动相比例变化±5%、流速相对值变化±20%、柱温变化±5℃、采用三根不同的色谱柱时仪器色谱行为的变化，每个条件各测试两次。从色谱图可见各条件下盐酸可乐定与杂质峰均达到基线分离，各条件下的含量数据(n=6)的相对偏差均不大于2.0%。通过上述试验可知，不同的色谱柱、流动相比例变化、柱温变化、流速变化，对盐酸可乐定测定结果没有显著影响，说明本方法耐用性良好。2.13 样品含量测定按2.2.2项下操作，测定3批珍菊降压片中盐酸可乐定的含量分别为99.32%,98.56%,100.12%。2.14 样品含量均匀度测定取样品10片，分别置100ml离心管中，照2.2项下，自“加0.01mol?L-1盐酸溶液25ml”起，依法测定每片中盐酸可乐定含量，计算|A+1.8S|值。结果3批|A+1.8S|值分别为6.47、10.26、8.41，均小于15，可见其含量均匀度良好。结论：通过方法学验证试验表明，该方法准确、快捷、灵敏、重复性好，可作为盐酸可乐定含量及均匀度质量控制的方法。3 讨论3.1 珍菊降压片中盐酸可乐定含量少，含量测定关键是前处理过程中要把其全部转移出来，同时又不引入过多干扰成分。我们采用了多种方法进行前处理，最后发现用本方法结果最理想。3.2 检测波长的选择，为减少溶剂和流动相的干扰，确保试验结果的准确性，根据盐酸可乐定的紫外吸收图谱，其最大吸收在205nm左右，同时考虑到试剂的末端吸收等因素，本实验选择210nm作为盐酸可乐定的紫外检测波长并选择乙腈作为有机相。【参考文献】[1] 中药质量标准分析方法验证指导原则[S].中国药典2010年版一部附录：130-131.[2] 杨继斌，汤晓枢.HPLC法测定珍菊降压片中盐酸可乐定的含量[J].药物分析杂志，2006,26(12)：1854-1856.
