清瘟解毒分散片质量标准研究

清瘟解毒分散片是由2005年版《中华人民共和国药典》(一部)收载品种清瘟解毒丸改剂型而来,由大青叶、玄参、牛蒡子、葛根、黄芩等16味中药组成,临床用于治疗外感时疫、憎寒壮热、头痛无汗、口渴咽干、痄腮、大头瘟等症[1]623。将丸剂改为分散片后,与原制剂相比具有溶出迅速、吸收快、生物利用度高、服用方便等优点[2]。为了更好地对该制剂进行质量控制,本试验对组方中的玄参、牛蒡子、葛根进行了薄层色谱(TLC)鉴别,并用高效液相色谱法(HPLC)对黄芩的有效成分黄芩苷进行了含量测定,为制定该制剂的质量标准提供依据。1 仪器与试药Agilent HP1100高效液相色谱仪(美国安捷伦);WFH-201紫外反射透射仪(上海精科仪器厂);BS110电子天平(北京塞多利斯仪器系统有限公司);KQ-100超声波清洗器(昆山市超声技术有限公司)。硅胶G板(青岛海洋化工有限公司)。甲醇为色谱纯(天津化学试剂有限公司);水为重蒸馏水;其他试剂均为分析纯。黄芩苷对照品(批号110715-200815)、牛蒡子苷对照品(批号110756-200110)、葛根素对照品(批号110752-200912)、哈巴俄苷对照品(批号110726-200610)均购自中国药品生物制品检定所。清瘟解毒分散片由甘肃中医学院附属医院自制,批号090901、090902、090903。2 定性鉴别2.1 玄参取本品粉末2 g,加甲醇1 mL,浸泡1 h后,超声处理15 min,滤过,滤液作为供试品溶液。取处方中除玄参外的其余药材,按照清瘟解毒分散片制备工艺方法制备缺玄参的阴性样品,将阴性样品按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。精密称取哈巴俄苷对照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,分别吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性样品溶液各5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇-醋酸-水(7∶1∶2)为展开剂,用展开剂预饱和15 min,展开,取出,晾干,喷以香草醛硫酸试液,热风吹至斑点显色清晰。结果供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性样品无干扰。2.2 牛蒡子取本品粉末1 g,加乙醇20 mL,超声处理30 min,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇2 mL使溶解,作为供试品溶液。取处方中除牛蒡子外的其余药材,按照清瘟解毒分散片制备工艺方法制备缺牛蒡子的阴性样品,将阴性样品按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。精密称取牛蒡子苷对照品,加乙醇制成每1 mL含5 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,分别吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性样品溶液各5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(40∶8∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性样品无干扰。2.3 葛根取本品粉末1 g,加甲醇10 mL,放置2 h,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇0.5 mL使溶解,作为供试品溶液。取处方中除葛根外的其余药材,按照清瘟解毒分散片制备工艺方法制备缺葛根的阴性样品,将阴性样品按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。精密称取葛根素对照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,做为对照品溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,分别吸取供试品溶液、对照品溶液与阴性样品溶液各10 μL,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(7∶2.5∶0.25)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外灯(365 nm)下检视。结果供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性样品无干扰。3 含量测定3.1 色谱条件色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相：甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2);检测波长：280 nm;流速：1.0 mL/min;柱温：25 ℃;理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于2500。3.2 溶液的制备3.2.1 对照品溶液的制备精密称定黄芩苷对照品适量,加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液,即得。3.2.2 供试品溶液的制备精密称定本品0.5 g,加70%乙醇50 mL超声处理(功率220 W,频率50 kHz)30 min,滤过,滤液置100 mL量瓶中,用少量70%乙醇分次洗涤容器和残渣,洗涤液滤入同一量瓶中,加70%乙醇至刻度,摇匀。精密量取1 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,即得。3.2.3 干扰试验按照清瘟解毒分散片制备工艺方法制备缺黄芩的阴性样品,将阴性样品按“3.3.2”项下供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性样品溶液各10 μL,分别注入高效液相色谱仪中。阴性样品色谱图中,在黄芩苷峰相应位置上无干扰。见图1。A BC注：A.对照品;B.供试品;C.阴性对照图1 清瘟解毒分散片HPLC图3.3 线性关系考察精密吸取黄芩苷对照品溶液(52 μg/mL)2、4、6、8、10 μL,按上述色谱条件测定,以进样量为横坐标,峰面积积分值为纵坐标,制备标准曲线,得回归方程Y=345.57X-20.65(r=0.999 8)。结果表明,黄芩苷进样量在0.104～0.520 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。3.4 稳定性试验取同一供试品溶液(批号090901),每隔1 h测定1次,进样10 μL,共测定5次,结果RSD=1.18%,表明供试品溶液较稳定。3.5 精密度试验取同一供试品溶液,重复进样10 μL,测定5次。RSD=0.98%。表明仪器精密度良好。3.6 重复性试验取同一样品,按“3.3.2”项下制备方法平行制备5份供试品溶液,照上述色谱条件测定,结果RSD=1.31%(n=5),黄芩苷含量平均值为9.525 mg/g,表明方法重复性良好。3.7 加样回收率试验精密称取已知含量的样品(批号20050901,9.64 mg/g)共6份,每份精密加入一定量的黄芩苷对照品(12.2 mg/mL),按“3.3.2”项下方法制备,照上述色谱条件测定,计算加样回收率,结果黄芩苷平均回收率为98.72%,RSD为2.14%。见表1。表1 黄芩苷加样回收率试验结果3.8 样品含量测定取样品3批,按“3.3.2”项下方法制备供试品溶液,分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL,按上述色谱条件测定,结果见表2。表2 样品含量测定结果4 讨论在黄芩苷的含量测定中,参考2005年版《中华人民共和国药典》(一部)黄芩苷含量测定[1]211项下方法和供试品溶液制备方法,以及清瘟解毒丸项下供试品溶液制备方法[1]623,以70%乙醇溶液为提取溶媒,对提取条件进行了筛选。试验结果表明,以70%乙醇50 mL超声提取15 min时黄芩苷含量为9.25 mg/g、提取30 min时黄芩苷含量为9.59 mg/g,70%乙醇回流3 h黄芩苷含量为9.60 mg/g。超声提取30 min黄芩苷含量与70%乙醇回流3 h相当,故以70%乙醇50 mL超声提取30 min为本品黄芩苷含量测定的提取条件。本研究分别对处方中的玄参、牛蒡子、葛根进行了定性检测,薄层鉴别专属性强,重复性好。采用HPLC测定黄芩苷含量,作为定性指标,阴性无干扰,试验测定结果表明,本方法操作方便,重复性好,结果准确,能对清瘟解毒分散片的质量进行有效控制。【参考文献】[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：化学工业出版社,2005.[2] 谢秀琼.中药新制剂开发与应用[M].2版.北京：人民卫生出版社,2000：208.