非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的制备与鉴定

  单克隆抗体非对称二甲基精氨酸（asymmetricdimethylarginine,ADMA）由蛋白内精氨酸残基胍基氮原子经蛋白精氨酸甲基转移酶催化生成[1].ADMA主要代谢途径经二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）水解成瓜氨酸和二甲胺[2.3].现已证明，体内存在ADMA调节一氧化氮（NO）生成的内源性机制，即ADMA能竞争性抑制一氧化氮合成酶（NOS）活性，减少NO生成，造成血管内皮功能紊乱并导致多种血管疾病的发生[3.4].血浆中ADMA水平的变化与多种心血管疾病之间存在密切关系，被认为是心血管疾病新的标志物。因此，建立有效监测体内ADMA水平变化的方法至关重要。因血浆中ADMA水平较低，因此检测较难。现在主要采用反向高相液相色谱（HPLC）联合荧光[5.6]和质谱（MS）[7.8]检测的方法。虽然这2种方法精确性、特异性高，但缺点是分析时间较长、样品处理复杂、机器昂贵，无法进行大样本分析，更不能应用到临床。作者预采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清或血浆中ADMA水平。ELISA法主要优点是可以高通量对样本进行检测，符合临床要求。  1材料与方法  1.1实验动物SPF级雌性Balb/c小鼠由维通利华公司提供，4~6周龄小鼠用于免疫，8周龄以上小鼠用于杂交瘤的腹腔积液制备。  1.2仪器与试剂小鼠骨髓瘤SP2/0细胞来源于北京正旦国际公司，Jurkat细胞购自北京协和医学院基础学院，抗原肽。KLH由北京中科亚光生物科技有限公司合成，弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自美国Sigma公司，蛋白质印迹试剂购自ThermoScientific公司，其他试剂购于国药集团化学试剂有限公司。  1.3方法  1.3.1ADMA免疫原的设计合成  1.3.1.1ADMA免疫原的设计根据文献报道，富含甘氨酸、精氨酸重复序列蛋白内的精氨酸易被甲基化修饰，作者通过此线索设计合成多肽序列，并利用同源模建等计算机虚拟技术模拟构建抗体的空间构象，进而通过柔性分子对接技术合理判定抗原。抗体相互结合的动态作用模式，确定抗体识别的功能抗原表位；借助抗原表位的结构特征设计含有8~10个ADMA肽段。最终确定免疫抗原的序列KLH.nADMA[nGR.GnP.nGR（状<8）],采用Fmoc/tBu策略进行合成，并利用蛋白质印迹和ELISA法对多肽产生的抗体进行特异性分析。  1.3.1.2ADMA免疫原的合成采用Fmoc/tBu策略进行合成。具体过程如下：（1）0.70gH.CTC树脂，用10mLDMF溶胀后抽滤。称取Fmoc.Arg（me2,as）。OH0.175g,用2mLDMF溶解后加入3mmol/LDIEA0.54mL,混合均匀后加入树脂中进行振荡。2h后抽滤，用DMF清洗树脂，用10mLDCM/DIEA/MeOH=80/15/5对未反应的活性位点进行封端反应30min.DMF清洗树脂6次。（2）向洗好的树脂中加3mL20%PIPE/DMF,摇动反应，抽滤，3mLDMF洗涤，再重复此过程一次。将去除Fmoc的树脂取小量进行茚三酮检测，检测结果为深蓝色。（3）称适量Fmoc.Ahx.OH、HOBt和BOP溶解于2mLDMF中，向其中加入0.80mL3mmol/LDIEA混合均匀后加入到树脂中，振荡反应。80min后取少量进行茚三酮检测，现象为亮黄色，证明反应完全。将反应液进行抽滤，并用DMF洗涤。（4）重复过程（2）和（3）步骤，加入Fmoc.Cys（Trt）。OH.除去Fmoc保护基后，依次用DMF洗涤，甲醇洗2次，抽干。（5）将切割试剂（5%TIPS/TFA）加入到待切的树脂中，振荡3h,将溶液过滤到离心管内，树脂用少量TFA洗3次，洗液并入滤液中，加入到大量冷的无水乙醚中使多肽沉淀析出，离心。用乙醚洗涤数次后干燥，即得到多肽粗品0.11g,粗品回收率66%.  1.3.1.3ADMA多肽纯化及结构表征分析采用HP1100型（美国安捷伦公司）反相HPLC仪对粗品进行纯化。并采用MALDI.TOFMS技术对纯化的多肽纯度和表征进行分析。  1.3.2免疫动物取4只4~6周龄雌性清洁级纯种BALB/c小鼠对其进行免疫。初次免疫，取100g免疫多肽与等量弗氏完全佐剂充分乳化，对小鼠进行皮下多点注射免疫。3周后用相同剂量的免疫原与等量弗氏不完全佐剂充分乳化免疫小鼠，方法同前。2周后独立免疫原免疫。在第3次免疫2周之后，尾静脉采血测效价，效价达到32000时使用100g免疫多肽进行小鼠腹腔加强免疫。  1.3.3细胞融合取完成免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞按10∶1的比例混合，在1min内加入预热的PEG1500,边加边轻轻搅拌，滴加完后静置60s.用吸管每隔2min加入1、2、3和5mL预热至37℃的不完全培养基，1000r/min离心5min,弃去上清液。加入5mLHAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后以100μL/孔加入96孔细胞培养板中，37℃，5%CO2培养箱中培养，1周后观察并换HT培养液继续培养。  1.3.4阳性克隆的筛选及克隆化用间接ELISA法对杂交瘤细胞培养上清双筛。BSA.nADMA作为初筛抗原，BSA.ADMA进行二次筛选。筛选抗原包被板的A450值高于阴性对照（正常小鼠血清）2.1倍为阳性，将此阳性孔杂交瘤细胞用有限稀释法克隆化培养，至所有杂交瘤上清液均呈阳性则建株。  1.3.5单克隆抗体腹腔积液的制备和纯化先给BALB/c小鼠腹腔内注射液体石蜡0.5mL,1周后腹腔注射能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞0.5mL（细胞数约为2×106个），10~14d后收集小鼠腹腔积液，用ProteinG纯化抗体，纯化后的抗体加入等体积甘油混匀，放置-20℃保存。  1.3.6单克隆抗体性质的鉴定取细胞培养上清或纯化抗体，直接用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试纸条进行抗体免疫球蛋白类鉴定，该鉴定试纸基于胶体金免疫分析技术，结果直观可肉眼判读。采用间接ELISA法测定单克隆抗体的效价，Brad.ford法测定抗体浓度。  1.3.7抗体亲和力的测定参照文献[9]所建立的间接ELISA法进行检测。以3种不同浓度（5、2.5、1.25mg/L）BSA.ADMA包板，加入倍比稀释的抗体，加二抗，TMB显色后测A450值。以抗体浓度的对数为横坐标，以A450值为纵坐标，可得出3条反应曲线。以每条曲线上部平坦段的A450值作为100%,在曲线上查出50%A450值时相对应的抗体浓度，分别为（Ab）t、（Ab′）t和（Ab“）t,当抗原包被浓度为2.5mg/L时，K1=1/2[2（Ab′）t-（Ab）t];K2=1/2[2（Ab”）t-（Ab′）t];当包被浓度为1.25mg/L时，K3=3/2[2（Ab“）t-（Ab′）t].这3个K值的平均值为亲和常数K.  1.3.8抗体识别特异性测定采用间接ELISA的方法检测单抗与BSA.ADMA结合特异性，并用筛选抗原BSA.nADMA作对照。另外采用Westernblot法对抗体进行特异性鉴定。处理Jurkat细胞裂解物后进行SDS.PAGE电泳，将电泳后的样品电转移至硝酸纤维（NC）膜。转移后用5%脱脂奶粉室温下封闭2h,加入1∶1000单克隆抗体，4℃过夜，TBS.T洗 后加入1∶1000的山羊抗小鼠IgG,37℃放置1h,常规洗膜后，加入化学发光试剂，用X线片显影、定影。  2结果  2.1ADMA多肽纯化及结构表征测定从液相图中可见在15.632min时有一个较强的出峰，且主要为1个峰，未见其他杂峰，说明得到的物质纯度比较高。六氨基己酸相对分子质量为131,半胱氨酸相对分子质量为121,衍生产物ADMA.ACA.CYS相对分子质量为454,在质谱图中可以看到，正离子液相1.75min出现的峰，其质谱图中含有m/z为420.41的碎片，推测其应为M+1峰，据此可推断抗原ADMA.ACA.CYS衍生化成功，见图1（见《国际检验医学杂志》网站主页”论文附件“）。  2.2免疫小鼠效价测定间接ELISA法测定免疫小鼠效价，选择血清效价大于32000的右前标记的小鼠脾脏用于即将进行的细胞融合，见图2（见《国际检验医学杂志》网站主页”论附件“）。  2.3单克隆抗体的性质测定经过多次双筛亚克隆后得到2株能够稳定分泌抗ADMA单克隆抗体的细胞株（22.1.1和38.1.6）。（1）抗体亚型：22.1.1和38.1.6细胞株分泌的抗体亚型为IgG2a1,见图3（见《国际检验医学杂志》网站主页”论文附件“）。（2）抗体的效价和蛋白浓度：间接ELISA测得抗体效价为1∶1.024×106,22.1.1亚型蛋白浓度为4.79mg/mL,38.1.6亚型蛋白浓度为2.86mg/mL,SDS.PAGE显示抗体纯度95%以上，见图4（见《国际检验医学杂志》网站主页”论文附件“）。（3）抗体亲和力：由此测得单抗的亲和常数K值为5.8×1010mol/L,见图5（见《国际检验医学杂志》网站主页”论文附件“）。2.4抗体特异性测定抗ADMA单克隆抗体不仅可以和BSA.nADMA反应，而且可以和BSA.ADMA反应，以BSA为对照时不与BSA反应。蛋白质印迹结果显示抗体可以和含有ADMA的蛋白反应。见图6（见《国际检验医学杂志》网站主页”论文附件“）。  3讨论  NO是血管内皮主要的内源性舒张因子，具有抑制动脉粥样硬化、平滑肌细胞增殖、血小板聚集和黏附、单核细胞黏附等多种功能[10.11].ADMA作为NOS的竞争性抑制剂会减少NO生成。已有大量文献证明ADMA升高是内皮功能障碍和心血管疾病的风险因子。心血管疾病的其他风险因素，如高血压、糖尿病、高胆固醇血症等都与NO生物利用度降低和功能障碍相关，因此推测ADMA可能是血管内皮风险因素的逆向最终调节因子。制备抗ADMA单克隆抗体用于ADMA检测、纯化的研究，具有广泛的应用前景。抗体是检测的重要工具，虽然现在国内市场有许多AD.MA试剂盒在出售，但抗体都是依靠进口，成本较高。本文设计了3种抗原，包括：免疫原（KLH.nADMA）和两种筛选抗原（BSA.nADMA和BSA.ADMA）。在筛选杂交瘤细胞株的过程中，首先经过间接ELISA双筛，免疫原为KLH.nADMA,用BSA.nADMA包板进行ELISA阳性筛选的同时，还用BSA蛋白包板进行阴性筛选，这样得到的杂交瘤细胞株只是针对nADMA多肽段，再用BSA.ADMA和BSA进行筛选，最后得到的杂交瘤细胞只是针对单个ADMA.Jurkat细胞株属急性T细胞白血病细胞系，含有ADMA蛋白。本文获得的ADMA单克隆抗体不仅使ADMA抗体国产化，并为ADMA的临床检验应用奠定了基础。  参考文献  [1]SedorisKC,OvechkinAV,GozalE,etal.Differentialeffectsofni.tricoxidesynthesisonpulmonaryvascularfunctionduringlungis.chemia.reperfusioninjury[J].ArchPhysiolBiochem,2009,115（1）：34.46.  [2]OgawaT,KimotoM,SasaokaK.Purificationandpropertiesofanewenzyme,NG,NG.dimethylargininedimethylaminohydrolase,fromratkidney[J].JBiolChem,1989,264（17）：10205.10209.  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