营养条件改变逆转MRS的研究

  耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（meticillinresistantstaphylo.coccusaureus,MRSA）是目前世界性医院内感染的重要病原菌之一。目前MRSA的感染流行已成为一项严重的临床及公共卫生问题[1].据美国疾病控制和预防中心（CDC）统计：美国院内感染MRSA分离率已超过80%[2];世界每年约有10万人感染MRSA,其所致感染与乙型肝炎、获得性免疫缺陷综合征（AIDS）同为当今三大感染性顽症[3].早在1992年就有文献报道，MRSA严重感染发生时，即使在使用万古霉素治疗的情况下，其病死率仍可达到10%~30%,有时甚至大于50%[4].凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）是一种机会致病菌，在机体抵抗力下降和医源性因素干预等的情况下亦可造成局部或大面积感染，临床以菌血症较为常见，其次是心内膜炎。耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS）某些菌株的耐药性可能比MRSA更强。可见由MRCNS引起的感染同样不容忽视。因此，对耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的耐药性进行研究与探讨，不仅有助于临床MRS严重感染的控制，还能为抗菌药物的开发与合理应用奠定基础。国内外先后有多位学者都对MRSA能否逆转为MSSA进行了相关研究，本文扩大了研究范围（增加了CNS），以MRS为研究对象，对改变营养条件能否逆转MRS为甲氧西林敏感葡萄球菌（MSS）进行了相关探讨。  1 材料与方法  1.1材料  1.1.1菌株来源53株MRS为2010年1月至2011年12月期间从湖南旺旺医院及中南大学湘雅二医院住院患者的血液、伤口分泌物、前列腺液、尿液、痰液及脓拭子等临床标本中分离所得。  1.1.2质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923,购自卫生部临检中心。  1.1.3主要仪器与试剂VITEK2.ComPact全自动微生物鉴定仪及药敏系统、Slidexstaphplus乳胶凝集法快速检测金黄色葡萄球菌（简称乳胶凝集试验）试剂均为法国生物梅里埃公司产品，PCR扩增仪和电泳仪购自德国Biometra公司，凝胶成像仪购自美国BioRad公司，细菌基因组DNA提取试剂盒和100bpMarker购自北京天根生化科技有限公司，不含染料的PCRMasterMix（内含有Tris.HCl、KCl、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶、ddH2O）购自索莱宝公司，药敏培基（水解酪蛋白）及药敏纸片、血平皿、普通营养琼脂、普通营养肉汤、脑心浸液基础试剂均购自英国Oxoid公司，mecA基因测序由上海生工生物有限公司合成。  1.2方法  1.2.1菌种鉴定按常规方法分离菌株，革兰阳性球菌呈葡萄状排列，血浆凝固酶玻片法、试管法、乳胶凝集试验均为阳性判定为金黄色葡萄球菌，均为阴性则判断为CNS.再经微生物分析仪鉴定确证。  1.2.2MRS筛查药敏纸片琼脂扩散法（K.B法）用头孢西丁（FOX）纸片，严格按美国临床和实验室标准协会（CLSI）操作要求及标准进行判断；结合微生物鉴定仪AST药敏卡结果及专家评论确证。  1.2.3营养条件设计与试验操作将已确定为MRS的菌株配成0.5麦氏浓度的菌液，分别取一环（固定的泊金环）接种在绵羊血脑心浸液肉汤（简称为A培养液）、普通营养肉汤（简称为B培养液）、血平皿、普通营养琼脂（简称为普皿），以及无菌生理盐水与B培养液按1∶1、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800稀释的肉汤中培养8~16h,每天分别取以上各液体培基中菌液一环，转种于各自相对应的培养基中。血平皿与普皿上的菌也每天同时转种，在相同条件下进行培养。3~5d后将A、B培养液，血平皿，普皿，以及5种不同比例稀释后的培养液中的细菌同时转种在新的血平皿与普皿上。取细菌按常规标准操作，先用手工进行FOX药敏试验，发现有FOX敏感株则立即用VITEK.2全自动微生物鉴定仪及手工法进行细菌鉴定与药敏分析。一方面确认试验前后菌种的一致性；另一方面证实原菌株是否经诱导后发生变化，即对FOX由原耐药（R）转为敏感（S），以下简称为诱变脱耐；同时观察所有诱导后的菌株对各种抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC）值及生化反应有无改变。 1.2.4mecA基因检测取试验原菌株与诱变脱耐菌株按文献[5]描述方法提取DNA.mecA基因扩增引物（上游：5′。AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC.3′，下游：5′。AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC.3′）由上海Invitrogen公司合成并纯化。通过PCR对mecA基因进行扩增，同时设阴阳性对照。扩增体系：扩增反应总体积为50μL,其中灭菌三蒸水23μL、10×PCR反应缓冲液5μL、15mmol/LMgCl225μL、2.0mmol/LDntp5μL、25pmolprimers各1μL、模板DNA10μL、1.5U犜犪狇DNA酶。置DNA热循环仪上进行自动化扩增反应。循环参数为94℃30s,55℃30s、73℃30s,共35个循环，最后一个循环于72℃延伸5min.以100bpDNAMarker为分子量标准，取5μL扩增产物与1μL上样缓冲液（6×Loadingbuffer）混匀后点样于含0.5mg/L溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶，140V电泳20min后，在凝胶成像仪中观察结果并照相。将PCR产物送上海生工生物技术有限公司测序。  2 结果  2.1营养条件改变后MRS耐药性逆转结果共收集53株MRS菌株。金黄色葡萄球菌（以下简称金葡）38株、表皮葡萄球菌（以下简称表葡）3株、人型葡萄球菌（以下简称人葡）2株、模仿葡萄球菌（以下简称模仿葡）2株、溶血葡萄球菌（以下简称溶葡）8株。53株菌中有6株由MRS逆转为MSS,其中4株金葡（4/38）、2株溶葡（2/8），分别编号为01号、12号、56号、57号、69号、71号。这6株菌接种在A、B培养液，血平皿与普皿中，连续转种80代未见改变。这6株菌在无菌盐水与普通营养肉汤稀释培养液中培养8~16h,连续转种5代时发现：01号菌株在1∶1稀释肉汤中FOX抑菌环由原6mm（R）转为24mm（S）；12号菌株经过30次转代时在1∶100稀释肉汤中FOX由原6mm（R）转为26mm（S）；69、71号菌株经过8次转代，56、57号菌株分别经过22、24次转代，于1∶1稀释培养液中诱导成功。而这6株诱变脱耐菌株对12种抗菌药物敏感情况在诱导后却发生了明显改变，见表1.FOX:头孢西丁，SAM:氨苄西林/舒巴坦，CM:克林霉素，RF:利福平，CZ:头孢唑啉，E:红霉素，GM:庆大霉素，LEV:左氧氟沙星，MXF:莫西沙星，TE:四环素，SXT:磺胺甲恶唑，VA:万古霉素；-:MIC值无明显改变。  2.2生化反应分析12号菌株和69号菌株诱变前β。D.半乳糖苷酶、尿素酶、D.核糖、精氨酸双水解酶均为阳性，诱变后全部转为阴性；56号菌株尿素酶改变与12号、69号菌株相同；57号菌株N.乙酰。D氨基葡萄糖、甲基。β。D.葡萄糖吡喃苷、精氨酸双水解酶皆由诱变前的阴性转为诱导后的阳性。01号和71号菌株由诱变前、后的生化反应改变完全一致，即尿素酶由阴性转为阳性，D.海藻糖、D.核糖、β。葡萄糖醛酸酶均由阳性转为阴性。69号菌、56号菌对杆菌肽由原敏感经诱变后转为耐受，其他4株菌诱变前后均为耐受。以上生化反应显示出了这6株菌在诱导前后有酶与糖类的改变。  2.3扩增产物分析01、56、57、69、71、12号这6株菌，经过PCR检测原试验株[FOX（R）]均有mecA基因（不含01号），见图1（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）；诱变脱耐后[FOX（S）]的01号、57号未检测到mecA基因。而12、69、56、71是菌株诱变后的mecA基因电泳带表现非常弱，几乎不见，见图2（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。以01号为代表株进行测序，PCR扩增产物电泳结果显示见图3（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。  2.4PCR扩增产物测序01号扩增产物诱导前细菌扩增出的特异性条带测序结果与mecA基因的序列完全相同，从而证实诱导前细菌中有mecA基因；01号诱导后细菌扩增出的条带测序结果与溶血性葡萄球菌（）JCSC1435一段基因序列部分相似（证实了01号溶血性葡萄球菌诱变前后的同源性）；诱导后未见mecA基因，而扩增出一条比预期相对分子质量偏大的非特异性产物。这表明诱导后mecA基因出现丢失现象。  3 讨论  MRSA的耐药机理：（1）主要是mecA基因编码的低亲和力的青霉素结合蛋白（PBP2a）的耐药性，为染色体DNA介导的固有耐药性；（2）属获得性耐药，由于质粒介导产生的β。内酰胺酶。来源于DNA的转导、转化、或其他类型的DNA的插入[5].目前国内外均有对MRSA脱耐的研究。王慧等[6]以聚乙烯亚胺（PEI）为载体，将硫代寡聚脱氧核苷酸（PS.ODNs）转导至MRSA体内，研究结果表明，PS.ODNs可部分逆转MR.SA对β内酰胺类抗菌药物的耐药性。宦梦蕾等[7]研究采用薄膜分散冻干法制备反义寡核苷酸阴离子脂质体，证实反义寡核苷酸脂质体能逆转MRSA的耐药性，且效果明显优于单用PSODNs.Klitgaard等[8]用硫利达嗪作用于MRSA,使laZ表达水平降低，进而降低PBP2a的水平。Lemaire等[9]研究发现酸性条件能恢复MRSA对β内酰胺类抗菌药物的敏感性。本研究通过对临床分离的53株MRS在无菌盐水与普通营养肉汤稀释后的液体培基中，连续传代培养，有6株MRS脱耐逆转为MSS,提示改变营养条件：（1）可以使MRSA逆转为MSSA,也可使MRCNS逆转。（2）经过PCR检测原53株试验菌均有mecA基因，而逆转成功后的6株菌，有两株未检测到mecA基因；另4株菌的mecA基因电泳带表现非常弱，几乎不见。这说明脱耐诱变株的mecA基因确实发生了改变。（3）53株试验菌仅6株诱变成功，且mecA基因表达程度不一。这可以说明葡萄球菌mecA基因表达的不均一性，同时也说明MRS菌株在基因组学上明显存在差异，与文献[10]报道相似。  综合以上情况，值得探讨的是：（1）MRS逆转成功的6株菌MIC值的改变，仅是耐药表型发生了改变，还是使其耐药机制发生了改变？（2）mecA基因的改变是丢失、脱落、或是隐藏？还只仅是表达下降？（3）曾有学者提出[10],若改善培养条mecA基因表达水平提高，原来敏感的菌株重新鉴定为耐药株。作者制备的营养条件恰恰是让原来耐药的菌株重新诱变为敏感株。微生物的致病能力与生物体的毒素因子和宿主的营条件关系密切№犲犮犃基因和细菌染色体上的一些辅助基因和调控基因共同作用下，影响细菌细胞壁合成，使细胞表现出异质性耐药№犲犮犃基因的表达受多种因素的影响[11].作者认为，低劣的营养环境能阻碍PBP2a产生，破坏细菌细胞壁及某些酶的合成；对黏附因子、毒素因子以及细菌生物膜的形成都有一定的遏制作用。本研究发现不同营养条件可以影响mecA基因的表达，引起了抗菌药物与某些生化反应的改变，究竟与某种辅助基因（如femABX新家族成员或是新的调控基因orf1、orf2、orfx）中DNA片段基因的转导、转化，或其他类型DNA的插入有无直接关系[10]（4）01号诱导后扩增出一条比预期相对分子质量偏大的非特异性产物又为何物？是否为与PBPs无关的新作用靶位？它在MRS的耐药与敏感中起什么作用？这都是值得继续研究与探讨的课题。作者希望本研究能为今后MRS感染的临床医学、预防医学提供一定依据。  参考文献  [1]耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染防治专家委员会。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染防治专家共识[J].中华实验和临床感染病杂志，2010,4（2）：215.223.  [2]徐振波，李琳，石磊。甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌多位点序列、SCCmec及随机扩增多态性DNA分型研究[J].中华检验医学杂志，2008,31（11）：1270.1272.  [3]徐邦牢，张革，马为。多重PCR法对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌染色体mec盒的分型研究[J].中华检验医学杂志，2007,30（8）：900.901.  [4]李仲兴，郑家齐，李家宏。诊断细菌学[M].香港：黄河文化出版社，1992:178.179.  [5]刘思平，江凌晓。MRSA耐药机理及其检测方法的研究进展[J].热带医学杂志，2007,7（10）：1030.1032.  [6]王慧，孟静茹，陈涛。反义寡核苷酸。聚乙烯亚胺纳米微粒逆转耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性的研究[J].中国临床药理学与治疗学，2008,13（1）：33.35.  [7]宦梦蕾，罗晓星，孟静茹。脂质体包裹的反义寡核苷酸逆转耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性的研究[J].中国临床药理学与治疗学，2006,11（9）：983.986.  [8]KlitgaardJK,SkovMN,KallipolitisBH,etal.Reversalofmethi cillinresistanceinStaphylococcusaureusbythioridazine[J].JAn. timicrobChemother,2008,62（6）：1215.1221.  [9]LemaireS,FudaC,VanBambekeF,etal.RestorationofSuscepti. bilityofmethicillin.resistantStaphylococcusaureustoβ。Lactam AntibioticsbyAcidicPh:roleofpenicillin.bindingproteinPBP2a[J].JBiolChem,2008:283（19）：12769.12776.  [10]李晓芳，范昕建。甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药基因与耐药性关系[J].中国抗生素杂志，2006,31（3）：140.142.  [11]余方友，陈增强，刘存丽。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌染色体mecI基因的检测及多态性研究[J].中华检验医学杂志，2007,30（7）：796.797  （收稿日期：2013.12.05）