Her-2基因启动子及第一内含子的生物信息学分析
发表时间：2012-12-04 浏览次数：1210次
作者 作者单位
潘峰 温州市肿瘤医院，浙江 温州 325000
王宇航 温州市肿瘤医院，浙江 温州 325000
大量研究表明，表皮生长因子受体2( Her2)的过表达与多种人类恶性肿瘤相关，虽然基因扩增是重要的原因，但是实验表明，在肿瘤细胞，无论基因是否扩增，过表达始终存在，即单位拷贝的mRNA数量仍是增加的，因此在Her2过表达中仍存在未知的调控因素。雌激素是否影响Her2的表达仍不清楚。由于启动子和第一内含子是调控基因的重要区域， 为初步了解影响基因表达的各种调控因素，我们对Her2基因的启动子和第一内含子进行了生物信息学研究。
1 材料与方法
1.1 材 料
从Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下载人(NC_000017)、小家鼠(NC_000077)、褐家鼠(Mus NC_005109)、家犬(NC_006591)Her2(erbb2)基因序列，全长的mRNA序列(人NM_004448.2、小家鼠NM_010152、褐家鼠NM_017003、家犬NM_001003217)，各基因上游1kb序列通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview获得。
1.2 方 法
参考文献[1]同时使用自编软件WYH1.0，比较Her2基因DNA和mRNA序列而获得转录起始位点、上游序列和第一内含子序列，使用Dnaman5.22进行同源性分析，在网站http://www.generegulation.com/cgibin/pub/programs/match注册后，在线使用Transfac6.0分析启动子序列调控位点，获得结果后再经人工仔细分析。使用WYH1.0.分析调控元件(motif)在基因中的分布状况。DNaseⅠ超敏感位点由文献获得[3]。
2 结 果
结合文献[1]和Transfac6.0分析表明，Her2基因具有经典的TATA盒启动子序列，紧靠TATA盒上游存在保守的CAAT盒、GGA镜像重复序列和多个 AP2调控位点(图1)，紧靠正常转录起始位点A下游还存在SP1位点， TATA盒的上游序列(164to282)存在5个SP1位点、1个YY1位点、1个PEA3位点和2个 AP2位点。在近端启动子区域还存在保守的cmyb和WT1连续序列。同源性分析表明鼠Her2基因的近端启动子(0到224)和人高度同源，但是不存在TATA盒，而CAAT盒、GGA镜像重复序列和多个 AP2调控位点依然保守，224以后的序列同源性下降，有较多的缺失，主要特点是AT丰富(图1未显示)。
第一内含子同源性分析表明，人小家鼠褐家鼠和家犬的Her2 mRNA相似性达81%，在删除家鼠褐家鼠DNA中插入序列后，第一内含子相似性为38%，第一内含子中存在的6个DNaseⅠ超敏感位点中， 在1、3、5/6超敏感位置的序列相似性达78%(图2)，其它同源区包括靠近两侧外显子的序列和第1、4敏感位点下游的小片断序列。 雌激素受体(ER)结合全位点如图2中表示。第5/6个超敏感位置位点含有10个ER半位点TGCC/TC和GG/AGCA，其出现频率为全基因序列中最高，小家鼠褐家鼠家犬的第一内含子同源区也存在类似调控序列， 但是这些位点序列都不保守。
3 讨 论
基因扩增是Her2过表达的重要原因，没有基因扩增的肿瘤细胞仍然存在Her2过表达，存在基因扩增的细胞， 单位拷贝的mRNA数量仍然是增加的[2]，因此Her2过表达仍是关键的致恶变机制。而且实验表明肿瘤细胞过表达的Her2基因转录起始位点较正常提前(图1B点)[3]，原因不明。
我们的分析提示启动子区存在多个调控因子结合位点，实验已证实的Her2正调控因子只包括AP2、PEA3、SP1、YY1等[4~6]， 因此我们主要分析这类因子的分布。结果表明，Her2基因具有经典的TATA盒启动子序列，紧靠TATA盒上游存在多个重要的保守的AP2调控位点、CAAT盒和GGA镜像重复序列，紧靠正常转录起始位点A下游还存在多个SP1位点。但是分析表明，远离TATA盒的上游序列(164to282)仍然存在5个SP1位点、1个YY1位点、1个PEA3位点和2个AP2位点。值得注意的是，实验表明显著影响转录活性的多个TATA盒上游序列 (213、506 AP2)仅对于Her2过表达的肿瘤细胞调控有效，而不影响正常细胞的转录活性[4]，这提示正常情况下远离TATA盒的上游序列调控可能不起主要作用，这与该区域不存在DNaseⅠ超敏感位点的实验结果一致(惟一的启动子区DNaseⅠ超敏感位点在TATA盒下游)，类似的证据还表现在与鼠启动子序列的对比研究，研究表明224以上的序列同源性较差，表现为有较多的缺失，而且没有保守的AP2、PEA3调控位点。
但在异常条件下，比如组蛋白乙酰化酶活性的增强，可能出现染色质结构的重建使上游的多个调控元件发挥作用[7]，导致出现高效的次要转录位点B。虽然位点B附近序列缺乏TATA盒和起始子(Inr)及DPE元件，但是作为管家基因，这类元件似乎并不是必须的，啮齿动物Her2启动子也没有TATA盒，上游丰富的SP1和AP2位点和细胞内高浓度的SP1和AP2是高效转录的主要因素。同时还发现在近端启动子区还存在保守的cmyb和WT1连续序列，但是未能查到有关实验资料。
临床上研究表明乳腺癌Her2与ER的表达互为相反，实验也表明雌激素可以下调Her2的表达。已知Her2基因仅存在7个DNaseⅠ超敏感位点(图2)，有研究表明Her2基因第一内含子区中的第3超敏感位点可能与此现象有关[8]，但Transfac6.0分析表明该位点并不存在ER结合全位点，反而存在与启动子中的一致的AP2结合位点，因此难以解释这种现象。
我们的分析提示第一内含子区中存在2个ER结合全位点， 同源分析表明mRNA相似性达81%，第一内含子相似性为38%，第一内含子第1、3、5/6超敏感位置的序列相似性达78%(图2)，提示这些位点是保守的序列区域，可能与调控和剪切有关，而2/4敏感位点同源性较差，可能是逐渐退化的序列。但是人Her2中存在的ER结合全位点，一个不存在于超敏感区域，一个位于非同源序列，而小家鼠褐家鼠家犬第一内含子中虽然同样存在ER全结合位点，同源性分析提示也不保守，因此通过ER全位点而抑制Her2表达的可能性不大。一般认为ER为同源或异源二聚体才起调控作用，但是也有研究表明单个ER半位点也有调控作用，而多个半位点的聚集有可能加强调控作用[9]，因此我们进一步分析了第一内含子中ER半位点的出现频率，表明第5/6超敏感位点含有10个ER相关的调控序列，其出现频率为基因序列中最高，小家鼠褐家鼠家犬的第一内含子的同源区也存在类似的高频率ER半位点。考虑基因调控的丰余性特点，ER可能通过多个半位点的结合而抑制Her2表达。
【参考文献】
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