超高效液相色谱-质谱内标法同时测定海洋药用生物中硝基呋喃类代谢物残留量

　　随着我国中药现代化项目的实施，中药材药物残留污染得到普遍关注，植物性中药材的残留污染“研究较多，而动物性药材的药物残留研究却很少。硝基吠喃类药物及其代谢产物吠喃哩酮代谢物3一氨基一2一嗯挫烷酮(AOZ),吠喃它酮代谢物3-氨基一5一吗琳代甲基一2一嗯哩烷酮(AMOZ),吠喃西林代谢物氨基脉(SEM)和吠喃妥因代谢物一氨基乙内酞脉(AHD)均可使实验动物发生癌变和基因突变，1995年起欧盟全面规定禁止使用吠喃类抗菌物质，在动物源性食品中不得检出吠喃类残留物。　　本文参考动物源性食品及水产品中硝基吠喃类药物残留检测方法，采用液相色谱串联质谱一同位素内标法检测海洋药用生物中的硝基吠喃类代谢物，前处理方法简单，灵敏度和准确度高。　　1仪器与试药　　UPLC超高效液相色谱仪(Waters公司)、Mi-cromassQuattroPremierXE三重四极杆串联质谱联用仪(Waters公司)、氮吹仪(N一EVAPlll)、高速冷冻离心机(日立CF16RX)。甲醇、乙睛、乙酸乙醋为Merk公司色谱纯试剂;其余均为分析纯试剂。　　AMOZ(批号080408),AOZ(批号090320)由Witega公司提供，SEM一HCl(批号80314),AHD一HCl(批号80213)购于德国Dr.E公司，内标物3CpsN一SEM,D4-AOZ,'3C3一AHD,D。一AMOZ购于Witega公司。药材海马、龟板、龟甲胶、鱼缥、海参、海米、牡砺肉、海胆黄、毛蜡肉、贻贝肉、乌贼、文蛤、海龙购于青岛同仁堂药店及农贸市场。　　2方法与结果　　2.1色谱条件色谱柱:WatersACQUITYUPLCTBEHC18(2.1mmx100mm,l.7N.,m);柱温:30℃;流速:0.2mL"min-1;流动相:A为0.1%甲酸溶液(含10mmol"L-1醋酸钱),B为甲醇;梯度洗脱:0一2.5min,A由60%->55%，保持1min,3.5一6.0min,A由55%一->40%;进样量:10。　　2.2质谱条件扫描方式:ESI;检测方式:MRM;毛细管电压:3.0kV;萃取锥孔电压:3V;RFLens0.3V;源温度:110℃;脱溶剂气温度:350℃;脱溶剂气流量:600L·h‘;锥孔气流量:50L·h’;碰撞室人口电压.-2;出口电压:1;MS1和MS2高、低分辨率均为13.0。子、母离子参数见表1。　　2.3对照品溶液的制备精密称取AOZ,AMOZ,SEM一HCl,AHD一HCl化合物对照品适量，加甲醇溶解并制成每mL含100N}g的对照品储备液并保存于冰箱中;精密量取上述储备液适量，加甲醇制成每1mL含1g的混合对照储备液。　　精密称取内标物D、AOZ,D。AMOZ,13C'sN一SEM,'3C3一AHD对照品适量，加甲醇溶解并制成每1mL含100g的内标对照储备液并保存于冰箱中;精密量取上述储备液适量，加甲醇制成每1mL含1},g的混合对照内标储备液。将上述混合对照内标储备液用甲醇稀释得每1mL含50ng的混合对照内标使用液。　　2.4供试品溶液的制备称取样品粉末2.0g于50mL离心管中，加人50p,g"L‘混合对照内标使用液40p,L，加0.125mol·L-'盐酸溶液10mL,50mmol"L-'2一硝基苯甲醛的二甲亚矾溶液200p,L,涡旋、混匀，37℃避光放置16h取衍生化好的样品在5000r·min离心10min,上清液转入另一离心管中，残渣弃去，上清液中加人0.1mol·L’磷酸二氢钾溶液1mL,0.8mol·L‘氢氧化钠溶液1mL，摇匀，调pH为7.4士0.2。离心管中加人乙酸乙醋5mL，振摇2min，离心，上清液转移至巧mL离心管中，用乙酸乙醋5mL重复提取1次，合并提取液,50℃氮气吹干，残渣用流动相[0.1%甲酸溶液(含10mmol"L'醋酸按)一甲醇(6:4)]1.0mL溶解。如果样液浑浊，加人水饱和的正己烷1.0mL,涡旋1min,5000r"min-‘离心5min，弃掉正己烷层，重复提取，直至下层溶液澄清，经0.22m微孔滤膜后供高效液相色谱一串联质谱测定。　　2.5标准曲线的制备精密量取混合对照储备液和混合对照内标使用液适量，按“2.4”项下供试品溶液制备方法制备，使4种硝基吠喃类代谢物最终测定浓度分别为0.5,1.0,2.0,4.0,10.0,20.0},g·L',4种硝基吠喃类代谢物内标物最终测定浓度均为2.0},g·L’。结果表明4种硝基吠喃类代谢物在0.5}20.O},g}L-’的范围内线性良好，回归方程，相关系数见表2。图1为4种硝基吠喃类代谢物衍生物浓度为4.0},g·L‘的选择离子色谱图，图2为4种内标物衍生物的选择离子色谱图。　　2.6出限和定量限的测定以硝基吠喃类代谢物1.0,g·L’的标准溶液的响应计算SlN=3时的溶液浓度，得出方法的检出限(LOD);以SlN=10时的溶液浓度，得出方法的定量限(LOQ)，结果见表2,4种硝基吠喃类代谢物衍生物浓度为1.0,g·L‘的选择离子色谱图见图3,　　2.7精密度试验取4种硝基吠喃类代谢物浓度为2.0,g}L-'的混合对照溶液在拟定的UPLC-MS/MS条件下连续测定6次，由定量离子的峰面积计算精密度，RSD分别为:A07为3.2%,AMOZ为3.1%,AHD为2.9%,SEM为2.1%，表明方法的精密度良好。　　2.8加样回收率试验取阴性样品，分别按样品中0.5,1.0,5.0,g·kg’水平添加一定量的4种硝基吠喃类代谢物标准液，内标物均按1.0g·kg‘添加，各重复测定3次，按“2.4”项下供试品溶液制备方法制备，在拟定的UPLC一MS/MS条件下测定峰面积，内标法计算回收率。结果见表3}　　2.9稳定性试验取4种硝基吠喃类代谢物浓度为2.0,g}L-‘的混合标准溶液，分别在制备后的0,3,6,12,18,24h时测定，根据4种硝基吠喃类代谢物的定量离子的峰面积计算精密度，RSD分别为:AOZ为3.8%，AMOZ为4.2%，AHD为3.9%，SE111为3.2%，结果表明4种硝基吠喃类代谢物在24h内基本稳定。　　2.10重复性试验称取6份阴性样品各2g(精确到0.01g)，按样品中1.0,g}kg’水平添加一定量的4种硝基吠喃类代谢物标准液，内标物均按1.0},g·kg’添加，重复测定6次，按“2.4'，项下供试品溶液制备方法制备，在拟定的UPLC一MS/MS条件下测定峰面积，内标法计算含量。4种硝基吠喃类药物的平均含量分别为AOZ为0.98},g·kg‘(RSD为4.1%)，AMOZ为0.92(RSD为4.0%)，AHD为0.96},g·kg’(RSD为3.9%)，SEM为0.97}g·kg(RSD为3.6%)。　　2.11样品测定样品按“2.4”项下方法提取，在拟定的UPLC一MS/MS条件下测定。结果均未检出石肖基吠喃类代谢物。　　3讨论　　本文结合海洋药用生物的特点，通过试验对前处理方法、液相色谱条件和质谱条件进行了优化，建立了专属性强的海洋药用生物中硝基吠喃类代谢物的LC一MS/MS检测方法，最低检出限低于0.1g·kg。该法的建立可以控制海洋药用生物养殖中违禁药物的使用，为人们安全用药提供保障。　　参考文献1 RONG Wei-guang(荣维广),GUO Hua(郭华),YANG Hong(杨红).Current research status in China on pesticide contamination of plant material used in making Chinese herbal medicines(我国中药材农药残留污染研究现状).Chin J Pestic(农药),2006,45(5):3022 CHEN An-zhen(陈安珍),TIAN Jin-gai(田金改),DU Qing-peng(杜庆鹏).Study on method for rapid determination of organophosphorus and carbamates pesticide residues in traditional Chinese medicines(中药材中有机磷和氨基甲酸酯农药残留的快速检测方法).Chin Pharm Aff(中国药事),2009,23(11):10633 DU Qing-peng(杜庆鹏),CHEN An-zhen(陈安珍),TIAN Jin-gai(田金改),et al.Study on method for rapid determination of cadmium(Ⅱ)in traditional Chinese medicines(中药材中重金属镉的快速检测方法研究).Chin Pharm Aff(中国药事),2011,25(8):776