高效液相色谱法同时鉴定保健胶囊食品中非法添加的9种降糖药成分

　　糖尿病属于常见、多发病，且随着人们生活水平的提高，其发病率在我国呈逐年上升趋势，已经威胁到大众健康。有些不法商家违反“食品不得加人药物”的规定，利用患者不愿服药而又急于治疗的心理，在保健食品中违规添加降糖类西药以虚假广告误导消费者，从中牟取暴利。在不知情的情况下患者若长期使用，会引起肝肾功能严重损害、低血糖反应、血细胞减少等不良反应。降糖类的保健品多为多成分中成药，在测定时对分析方法的选择性提出了更高的要求。用高效液相色谱法同时测定磺酞脉类、双肌类中的9种降血糖西药成分，可实现组分的完全分离，快速准确。　　1仪器与试剂　　1.1仪器美国Waters高效液相色谱仪，包括2487紫外检测器、DAD2996型二极管阵列检测器、全自动进样器、柱温箱、超声波清洗器。　　1.2试药及试剂　　对照品:盐酸苯乙双肌(批号100922一201001、纯度99.7%)、格列本脉(批号100135-200404)、格列齐特(批号100269一201004)、格列毗凑(批号100281-200602)、格列喳酮(批号100280一201002)、格列美脉(批号100674一201102)、马来酸罗格列酮(批号100952一2007叫、瑞格歹叮奈(批号100753一201102)、盐酸毗格列酮(批号100634-200401)，均由中国食品药品检定研究院提供。甲醇为色谱纯;磷酸二氢馁、十二烷基硫酸钠、三乙胺为分析纯;水为纯化。　　样品:市售降糖保健胶囊类食品，共9个厂家21批。(厂家A，批号20120412,20120420,20111101,20110901、111102、20111118、201200507;厂家B，批号120206001,120101030,120312010,120206001,12010103020;厂家C，批号20120701,20120101,120301;厂家D，批号DL02128;厂家E，批号20120507;厂家F，批号201200101;厂家G，批号20120201;厂家H20120403;厂家I，批号20111221).2实验部分　　2.1色谱条件色谱柱:大连依利特C18(4.6mmx250mm,5N,m);流动相:0.02mol·L的磷酸二氢钱(含十二烷基硫酸钠0.03%，用三乙胺调节pH至3.510.O5甲醇;梯度洗脱程序见表1;流速:1.OmLmin一1;检测波长:235nm;柱温;35℃;进样量:20pL.　　2.2系统适用性试验取混合对照溶液进样，记录色谱图。结果盐酸苯乙双肌、格列毗嗓、格列齐特、马来酸罗格列酮、盐酸毗格列酮、格列本脉、格列美脉、格列喳酮、瑞格列奈的保留时间分别为5.91,14.27,14.85,21.48,24.65,26.44,32.16,40.10,44.03min，与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论板数均大于30002.3混合对照品溶液的制备精密称取对照品盐酸苯乙双肌、格列本脉、格列齐特、格列毗嗦、格列喳酮、格列美脉、马来酸罗格列酮、瑞格列奈、盐酸毗格列酮20mg，分别加甲醇25mL，作为对照品储备液，分别取5mI,置100mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。　　2.4供试品溶液的制备精密称取1次日常服用量的调节血糖的保健胶囊食品样品，置50mL量瓶中，加甲醇20mL，超声(50kHz,100W)30min使样品充分溶解，冷却至室温后用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，续滤液经0.45m微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。　　3结果与讨论　　3.1线性关系考察分别取“2.3”项下混合对照品溶液适量，加甲醇稀释至浓度约为4.0,8.氏16.氏32.0,40.0,60.0,80.0},g·mL溶液，分别取20},L注人液相色谱仪，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标得各降糖成分刊照品的线性回归方程和相关系数，见表203.2精密度试验取浓度为40.0g}mL的混合对照品溶液，重复进样6次，各组分峰面积的RSD均小于1.5%，说明仪器性能良好。　　3.3检测限和定量限取准确度试验用溶液稀释成不同浓度溶液，各取10},L进样，计算各色谱图主峰峰高与噪音响应比值，浓度为0.1gmL时，信噪比大于3:1为检测限;浓度为0.4igmL时，信噪比大于10:1为定量限。　　3.4准确度试验精密称取一定量1次日常服用量调节血糖的保健胶囊食品阴性样品，置50mL量瓶中，精密加浓度为8,32,60},g·mL的混合对照品溶液1mL，精密加甲醇稀释，使对照液和甲醇液共成20mL，超声30min使溶解，冷却至室温后用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，续滤液经0.45m微孔滤膜过滤，取20},L进样，结果见表3。　　3.5样品的检测结果将调节血糖的21批保健胶囊食品按实验方法测定，从3D图谱中提取光谱图谱及相关参数，9种对照品成分可完全分离，样品I每100g检测出含马来酸罗格列酮346.27mg和格列唆酮115.81mg，检测出的组分与相对应的对照品保留时间基本一致，并利用峰纯度与光谱匹配度比较，结果见表4。纯度角度和匹配角度好、均小于17值，说明这2种成分为单一组分，即此厂家的这批样品中检出2种具有降糖作用的组分。其余样品检测显示为阴性，混合对照品、阴性及阳性样品色谱图见图1。　　4讨论　　4.1目前，测定临床上常用降糖药磺酞脉类、双肌类西药的高效液相色谱法一般需要把这两类药分开进行测定，同时测定几个组分的文献较少，而液质法、液相色谱一串联质谱法的设备投资大、不宜推广使用。　　4.2在200}400nm的范围内，通过二极管阵列检测器对混合对照品进行扫描，提取9成分不同波长处的三维光谱图进行对比分析，在210一280nm均有较强吸收且吸收光谱且曲线较平滑，235nm波长能使所有组分有较灵敏且近似的响应值，溶剂峰的干扰也小，故选择235nm作为测定波长，见图2.　　4.3参照2010年版中国药典检测格列本脉的流动相，采用甲醇一磷酸二氢钱等度洗脱，但有些成分与杂质峰的分离不好。在摸索流动相及配比时，查阅相关文献,经过摸索，最终确定本文的流动相和梯度洗脱的比例。对照品各峰分离好，出峰时间短，基本可以达到很好的分离。　　4.4因9种降糖药品的极性有一定差异，而保健品中大多数样品中有浸膏、多糖等比较粘稠的成分，若用水或含水相的流动相溶解，会给下一步的过滤工作带来处理困难[巧〕，所以选择甲醇作为溶剂。　　参考文献1 DONG Yong-cheng(董永成),DU Shi-ming(杜士明),CHEN Yong-shun(陈永顺),et al.Types and harm of illegally added chemical in Chinese traditional patent medicine and health food as well as counter measure against the phenomenon(中成药及保健品非法添加化学成分的类型、危害及对策).Lishizhen Med Mater Med Res (时珍国医国药),2006,7(8):16012 XU Hao(徐浩).Instructions of Drug in Clinical(临床用药须知).Tianjin(天津):Tianjin Electronic Publishing House(天津电子出版社),2005.11793 PAN Yu-hong(潘宇宏),WANG Shi-ping(王仕平),Yan Min-ying(晏敏英),et al.Test methods of adding phenformin hydrochloride in preparations drugs and health food( 降糖类药品与保健食品中掺入盐酸苯乙双胍的检测方法).China Pharm(中国药业),2008,17( 16):364 ZHANG Yu-juan(张玉娟),TIAN Jing-zhen(田景振),FU Ying-jie(付英杰).Determination of glibenclamide in Xiaokeling capsule by HPLC(HPLC测定消糖灵胶囊中格列本脲的含量).Food Drug(食品与药品),2005,7(4):525 SUN Yu-ming(孙玉明),SUN Ling-ling(孙苓苓),ZHONG Da-fang(钟大放).Detection of glyburide in traditional Chinese medicine by liquid chromatography-mass spectrometry method(液相色谱-质谱联用法检测某些中药制剂中的格列本脲).Chin J Pharm Anal(药物分析杂志),2005,25(3):326