复方五仁醇胶囊保肝作用的血清药理学研究

作者                          作者单位

张兵              南通大学附属南通第三医院，南通226006

窦志华            南通大学附属南通第三医院，南通226006

罗琳              南通大学附属南通第三医院，南通226006

达坤林            南通大学附属南通第三医院，南通226006

中药“血清药理学”是指在动物经口服给药一段时间后采血分离血清，用此含药血清进行体外药理实验的一种实验方法，该方法作为中药研究的新思路和新方法而倍受推崇。复方五仁醇胶囊是我院研制的以五味子为君药的治疗慢性肝炎的科研制剂，我们对该制剂进行了“血清药理学”研究的方法学探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SD大鼠，SPF级，体重230±19.8 g，雌雄不拘，由南通大学实验动物中心提供。

1.1.2 试剂与试药 羟乙基哌嗪乙磺酸(香港FARCO公司);乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(美国AMRESCO公司分装);胶原酶IV(美国Sigma公司分装);胰蛋白酶(美国Sigma公司分装);DMEM培养基(美国GIBCO公司);新西兰新生小牛血清(美国HyClone公司);四氯化碳(宜兴市第二化学试剂厂);溴化3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑蓝(MTT，AMRESCO公司);五味子乙素(中药固体制剂制造技术国家工程研究中心);复方五仁醇胶囊(本院自制)。

1.1.3 仪器 HERA cell CO2培养箱(德国GmbH公司);BIO-TEK340酶标仪(美国Sigma公司);日立7170全自动生化分析仪(日本日立公司);Agilent 1100 Series高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠灌胃用药物的处理 取复方五仁醇胶囊内容物，加0.5%CMC-Na制成混悬液。另取复方五仁醇胶囊内容物，甲醇回流提取，加0.5%CMC-Na制成混悬液。

1.2.2 肝细胞的分离与培养 按文献[1]方法分离大鼠肝细胞，并以1×105/cm2接种于96孔及48孔培养板中，置CO2培养箱(5%CO2)37℃培养。

1.2.3 含药血清制备方法考察Ⅰ 给药形式及剂量考察取SD大鼠20只，随机分成5组(制剂原形组，提取物小剂量、中剂量、大剂量组和空白组)，每组4只，禁食12 h。制剂原组组每天按照成人临床等效剂量的10倍分两次灌胃制剂混悬液，提取物小剂量、中剂量和大剂量组同法分别灌胃5、10和20的提取物混悬液，连续给药3天，末次给药后1 h颈总动脉取血，4℃过夜，分离血清，空白组每天0.5%CMC-Na 灌胃，同法制备空白血清。

取培养24小时的肝细胞，吸弃上清液，随机分成6组(正常对照组，模型对照组，制剂原形组，提取物小剂量、中剂量、大剂量组)，每组设6个复孔。除正常对照组外，每孔加入含CCl4的DMEM及相应含药血清(模型对照组为空白血清)，CCl4和血清的终浓度分别为10 mmol/L和10%，正常组相应加入DMEM培养液和空白血清。作用24 h后，收集48孔板中培养上清液检测ALT。96孔板中每孔加入5 mg/ml的MTT液20 μl，继续孵育4h，每孔再加入DMSO 200 μl，振荡后，用酶标仪于波长570 nm测吸光值A。

1.2.4 含药血清制备方法考察Ⅱ 其他条件的正交试验考察 以动物是否造模、给药间隔时间、取血时间、取血成分为考察因素，每个因素设2个水平(见表1)，选用L8(27)正交表安排试验。取SD大鼠32只，随机分成8组，每组4只，其中肝损伤模型大鼠给药前24 h腹腔注射CCl4 1.0 ml/kg。各组每天按照成人临床等效剂量的10倍分两次灌胃提取物混悬液，末次颈总动脉取血，血浆组血液立即离心分离血浆，血清组血液4℃过夜，分离血清。

取培养24 h的肝细胞，吸弃上清液，随机分成8组，分别用以上制得的含药血清(血浆)按1.2.3相应方法处理，测定ALT及吸光值A。

按文献方法[2]制备对照品及含药血清(血浆)供试品溶液，注入液相色谱仪，测定五味子乙素含量。

1.2.5 体系中含药血清添加量考察 取培养24h的肝细胞，弃上清液，随机分成6组(正常对照组，模型对照组，5%、10%、20%、40%含药血清组)，每组设6个复孔。模型对照组和各含药血清组更换为加入CCl4 10 mmol/L的DMEM培养液，正常对照组相应加入DMEM培养基，正常对照组和模型对照组加入终浓度为10%的空白血清，各含药血清分别组加入按1.2.4中正交试验1号方案制备的含药血清，使终浓度分别为5%、10%、20%和40%。作用24 h后，按1.2.3相应方法处理，测定ALT及吸光值A。

1.2.6 统计学方法 使用Stata7.0统计软件包进行数据处理。数据以x±s表示，用方差分析处理数据。

2 结 果

2.1 含药血清制备方法考察Ⅰ：给药形式及剂量考察 与正常对照组相比，模型对照组MTT值显著下降(P<0.01)、ALT显著升高(P<0.01)，说明造模获得成功;与模型对照组比较，除提取物小剂量组MTT值无显著差异外(P>0.05)，其余各试验组MTT值均明显升高(P<0.01或P<0.05)，ALT明显下降(P<0.01或P<0.05);与提取物中剂量组比较，等剂量灌胃制备的制剂原形组MTT值及ALT差异均无统计学意义(P>0.05)。结果提示，制剂的甲醇提取物与制剂原形具有等效性，且3个剂量组不存在明显的量效关系。故确定以成人临床等效剂量10倍的甲醇提取物给大鼠灌胃制备含药血清。见表2。

2.2 含药血清制备方法考察Ⅱ：其他条件的正交试验考察 将各试验组3个指标的测定结果分别按百分制转换成积分(MTT、五味子乙素以最高为100，ALT以倒数计算，最高为100)，综合加权评分(MTT、ALT、五味子乙素分别占35%、35%和30%)后进行统计分析。结果见表3。

方差分析结果显示，C因素(取血时间)对结果有极显著影响(P<0.01)，B因素(给药间隔时间)有显著影响(P<0.05)，且两者之间存在交互作用(B×C之P<0.05，交互作用分析显示最佳组合为B1C1)，血浆的影响优于血清，但无统计学意义(P>0.05)，而动物是否造模几乎没有影响(见表4)。

因此，含药血清制备方法可定为A1B1C1D1，即每天间隔8 h给正常大鼠灌胃给药2次，连续3天，末次给药后2 h取血分离血清。

2.3 体系中含药血清添加量考察 与模型对照组比较，各浓度含药血清组MTT值均明显升高(P<0.01或P<0.05)，ALT均显著下降(P<0.01);与10%含药血清组比较，20%、40%含药血清组MTT值明显下降(P<0.01或P<0.05)，5%含药血清组无显著差异(P>0.05)，5%、20%、40%含药血清组ALT均明显升高(P<0.01或P<0.05)。提示体系中加入10%的含药血清效果最佳(见表5)。

3 讨 论

目前含药血清的制备多数采用药效指标考察，少数考虑化学指标，且忽视了各影响因素的交互作用。本课题采用药理和化学指标相结合加权评分的正交试验，发现存在交互作用。

理论上讲，宜采用病理状态下的动物制备含药血清[3]，但是，本研究结果显示，动物是否造模几乎对结果没有影响，与文献报道一致[4]。

有学者提出“血浆药理学”优于“血清药理学”[5]，本研究结果显示，血浆与血清对结果的影响虽然没有统计学差异，但直观分析前者优于后者，与先期发现的血浆中药效成分含量高于血清的结果[2]一致，后续研究应该注意。

研究结果显示，含药血清浓度超过一定范围药效反而降低，这可能是由于血清浓度过高会产生一定的细胞毒性[6]。

【参考文献】

[1] 徐淑云. 药理实验方法学[M]. 第3版. 北京：人民卫生出版社，2002：581-583.

[2] 罗 琳，窦志华，丁安伟，等. 大鼠灌胃复方五仁醇胶囊后血清和血浆中五味子醇甲和五味子乙素的比较[J].中草药，2006，37(10)：1486-1489.

[3] 张声鹏，施旭光，桂蜀华.关于中药血清药理学中血清供体动物是否造模的思考[J].中国中西医结合杂志，2001，21(5)：388-389.

[4] 阴赪宏，李兰芳，金亚宏，等.当归补血汤肝损伤小鼠含药血清抑制肝组织LPO生成的作用[J].中国实验方剂学杂志，2000，6(5)：32-34.

[5] 贺石林，葛金文，贺 蓉，等.质疑血清药理学，加强多层次半体内实验研究[J].中国药理学通报，2005，21(3)：277-279.

[6] 王 霖，张 云，汪受传.中药血清药理学研究中含药血清添加量问题的商榷[J].山西中医，2006，22(1)：51-52.