安肠愈疡汤合加味生肌散对实验性溃疡性结肠炎大鼠的药效学研究

作者                          作者单位

石敏           山东中医药大学附属医院，山东 济南 250001;

溃疡性结肠炎(UC)是以腹痛腹泻、粘液脓血便持续或反复发作为主要症状，并可伴有不同程度的关节、皮肤、眼、口及肝胆等肠外表现，以直肠、结肠粘膜及粘膜下层炎症和溃疡形成为病理特点的慢性非特异性肠道疾病。近年来我国患病率呈明显上升趋势[1]。该病发病原因及机制尚不完全清楚，加之缠绵难愈，复发率高，且有癌变倾向，目前尚缺乏满意的治疗方法，已被WHO列为现代难治病之一[2]，因此有关其病因病机的探讨以及治疗药物的研发已成为近年来的研究热点。我院以自拟中药方安肠愈疡汤口服合加味生肌散灌肠治疗该病，取得了良好的临床疗效[3]。本研究进一步从实验角度观察安肠愈疡汤合加味生肌散的抗炎、镇痛作用及对实验性溃疡性结肠炎的疗效，以探讨其作用机理。

1 材料与仪器

1.1 动物昆明系雄性小鼠150只，8～9周龄，体质量18～22 g;SD雄性SPF级大鼠90只，体质量180～200 g(均由山东中医药大学动物实验中心提供)，SCXK(鲁)2005- 0015。

1.2 药品、试剂及仪器安肠愈疡汤(黄芪、白术、黄连、地榆、木香、当归、白芍、防风、甘草等)与加味生肌散(白及、三七粉、败酱草、儿茶、苦矾等)煎剂：浓缩至含生药量为2.00 g/ml(由本院中药房提供);阿斯匹林：0.3 g/片，鲁抗制药有限公司生产，批号20080723;柳氮磺胺吡啶(SASP)肠溶片：0.25 g/片，上海信谊嘉华药业有限公司生产，批号20081012);醋酸泼尼松：上海三维制药有限公司生产，批号20070916;二甲苯，北京益利精细化学品有限公司，批号20080122 ;冰乙酸，北京益利精细化学品有限公司，批号20070520，2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS )购于北京邦定泰克生物技术有限公司;髓过氧化物酶(MPO)购于南京建成生物工程研究所，试剂批号20080411。721型分光光度计，上海第三分析仪器厂;超声波细胞粉碎机，型号:JY92-Ⅱ，宁波新芝科器研究所制造;酶标仪Bio-RAd,250型，美国制造。

2 方法

2.1 抗炎实验观察各组对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响。取小鼠75只，随机分为5组：空白对照组，泼尼松组，安肠愈疡汤组，加味生肌散组，安肠愈疡汤合加味生肌散组，每组15只。按0.02 g 药物/g体质量分别给予相应药物灌胃或/和灌肠，空白对照组给予等体积生理盐水，1次/d，连续3 d，在末次给受试药物1h后，于每只小鼠右侧耳壳正、反两面均匀涂抹致炎剂(二甲苯)，0.05 ml/只，1 h后处死小鼠，于双耳分别取直径6 mm的耳片，以两耳片重量之差作为肿胀度，求出给药组的肿胀抑制率。

2.2 镇痛实验观察各组对小鼠热板法镇痛实验的影响。取小鼠75只，分组及给药同上，各组15只。给药前先测各鼠的痛阈值。调节恒温装置使水温控制在(55±0.5)℃，每次在热板上放1只小鼠，将合格小鼠随机分为5组，重复测其正常痛阈平均值，作为该鼠给药前痛阈值。然后按0.02 g药物/g体质量分别给予相应药液(同前)灌胃灌肠，空白对照组给予等体积生理盐水，1次/d，连续3 d，分别于末次给药后30，60，90 min测小鼠痛阈值。

2.3 观察各组对UC大鼠结肠大体形态和组织学损伤及MPO活性的影响

2.3.1 动物分组取雄性SPF级(体质量180～200 g)SD大鼠90只，随机分成正常对照组、模型组对照组、安肠愈疡汤合加味生肌散组、安肠愈疡汤组、加味生肌散组、柳氮磺胺吡啶(SASP)组，每组15只，除正常对照组外，余复制UC模型。

2.3.2 大鼠溃疡性结肠炎模型建立采用2，4，6三硝基苯磺酸(TNBS)法造模[4]：将大鼠禁食(不禁水)24 h后1%硫喷妥钠溶液腹腔注射麻醉，用直径2.0 mm的硅胶管由肛门轻缓插入深约6 cm处的肠腔内，将30 mgTNBS(0.6 ml)的50%乙醇(0.25 ml)溶液0.85 ml快速注入，待麻醉清醒后正常喂养。

2.3.3 给药方法造模后第3天开始用药，正常对照组和模型组对照组给予生理盐水，按10 m1/kg体质量灌胃;安肠愈疡组：给予安肠愈疡汤浓煎剂，按0.02 g生药/kg体质量灌胃;加味生肌散组：给予加味生肌散浓煎剂，按0.02 g生药/kg体质量灌肠;安肠愈疡汤合加味生肌散组：给予安肠愈疡浓煎剂灌胃同时予加味生肌散浓煎剂灌肠，SASP组：给予SASP混悬液,按0.3 g/kg体质量(相当于人的中等治疗量)灌胃，以上各组均10 ml/kg体质量，1次/d，连续用3周。

2.3.4 取材用药3周后,各组存活大鼠一并处死取材：取距肛门以上约6 cm结肠段，根据炎症损伤程度进行结肠组织大体形态损伤评分。评分标准[5]：0分：无损伤;1分：局部充血、水肿但未出现溃疡;2分：有溃疡，但没有明显炎症;3分：有溃疡，仅有一处出现炎症;4分：有多处溃疡和炎症，溃疡大小<1 cm;5分：有多处溃疡和炎症，至少有一处溃疡大小>1 cm。然后取病变最明显处肠组织0.5 cm,以甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，HE染色，镜下评价炎症和溃疡等[6]。再留取各大鼠结肠病变最明显处组织若干，干冰速冻，置-80 ℃冰箱冷冻保存以备检测MPO。

2.3.5 髓过氧化物酶(MPO)活性测定取融冻后大鼠结肠组织，入缓冲液中，经匀浆、4 000 r/min离心15 min，上清液加入50 mmol/L PBS 2.9 ml中(含0.167 g/L邻联二茴香胺和0.000 5%的H2O2)于460 nm处测吸光度A值，5 min后再次测定，2次A值相差数除以5，即为该样品的MPO单位。1单位MPO活性表示25℃下1 min内将1 μmol H2O2转化成水造成A值变化的程度(即按每分钟A值变化1.0为1个酶活性单位)，以U/g组织表示。

2.4 统计学处理实验数据以±s表示，用SPSS15.0进行方差分析及析因分析。

3 结果

3.1 抗炎实验单因素方差分析及两两比较结果(见表1)显示，各观察组与对照组比较，均有显著差异(P<0.01)。提示各观察组对二甲苯所致小鼠耳肿胀均有不同程度的抑制作用，其中安肠愈疡汤合加味生肌散组与泼尼松组的抑制作用最强，两组差别无统计学意义(P>0.05),而与安肠愈疡汤组、加味生肌散组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。析因分析结果显示，安肠愈疡汤与加味生肌散的交互作用没有统计学意义(P>0.05)，表明安肠愈疡汤合加味生肌散的药效作用是安肠愈疡汤与加味生肌散独立的联合作用。表1 对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响(略)

3.2 镇痛实验各观察组对热刺激引起的疼痛反应均有不同程度的抑制作用，与对照组比较，均有显著性差异(P<0.01);其中安肠愈疡汤合加味生肌散组与阿司匹林组的镇痛作用最强，两组差别无统计学意义(P>0.05)，而与安肠愈疡汤组、加味生肌散组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。析因分析结果显示，安肠愈疡汤与加味生肌散的交互作用没有统计学意义(P>0.05)，表明安肠愈疡汤合加味生肌散的镇痛作用是安肠愈疡汤与加味生肌散独立的联合作用。表2 对小鼠热板法镇痛实验的影响(略)

3.3 各组大鼠结肠大体形态和组织学损伤评分及MPO活性的比较见表3。肉眼及显微镜观察发现：

正常对照组：肉眼见结肠皱壁规整、血管纹理清晰，未见糜烂及溃疡。显微镜下，结肠各层结构清晰。黏膜上皮细胞排列整齐，肠腺规则极向明显，杯状细胞丰富，间质未见充血水肿(见图1)。

模型对照组：肉眼见结肠黏膜明显的充血、水肿、出血灶及多个糜烂及溃疡面。显微镜下见黏膜层大片缺失，溃疡面较大且深达肌层，黏膜及黏膜下层有大量炎性细胞浸润，可见隐窝脓肿，黏膜腺体、杯状细胞明显减少(见图2)。

安肠愈疡汤合加味生肌散组：肉眼见结肠皱壁规整，局部黏膜轻度充血水肿，未见糜烂及溃疡面。显微镜下可见黏膜上皮基本完整，腺管排列尚整齐，极向明显，杯状细胞较丰富;黏膜及间质轻度充血水肿，见少量淋巴细胞(见图3)。

SASP组：肉眼可见结肠皱壁规整，黏膜轻度充血水肿，未见糜烂及溃疡面。显微镜下可见黏膜上皮基本完整，腺管排列欠整齐，杯状细胞尚丰富;黏膜及间质轻度充血水肿，见少量中性粒细胞及淋巴细胞(见图4)。

安肠愈疡汤组：肉眼可见结肠欠规整，黏膜轻至中度不等充血、水肿，可见少许糜烂面。镜下见黏膜上皮局部缺失，腺管排列欠整齐，杯状细胞尚丰富;局部黏膜及间质充血水肿明显，局部有明显的炎性细胞浸润，杯状细胞减少(见图5)。

加味生肌散：肉眼均可见黏膜轻至中度不等充血、水肿，偶见局部点片样的糜烂面。显微镜下可见部分黏膜上皮缺失，腺管排列不整齐，偶见较浅表溃疡，溃疡旁可见部分上皮修复，黏膜下水肿明显，肠腺及间质可见较多炎细胞浸润，杯状细胞减少(见图6)。

由表3可知，模型对照组大鼠结肠大体形态和组织学损伤记分及MPO活性均明显高于正常对照组(P<0.01)，说明造模是成功的。各观察组与模型对照组比较：各观察组结肠黏膜大体形态和组织学损伤程度均有不同程度的改善,大体形态和组织学的损伤记分均明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，反映中性粒细胞和炎症程度的MPO活性也明显低于模型组(P<0.05或P<0.01)。各观察组之间比较：无论大体形态及组织学的损伤记分还是MPO活性，安肠愈疡汤合加味生肌散组与SASP组均明显低于其它两组(P<0.05或P<0.01)。析因分析结果显示，安肠愈疡汤与加味生肌散的交互作用没有统计学意义(P>0.05)，表明安肠愈疡汤合加味生肌散的作用是安肠愈疡汤与加味生肌散独立的联合作用。表3 各组大鼠大体形态评分、组织学损伤评分及MPO含量(略)

4 讨论

溃疡性结肠炎可归属中医学“休息痢”“久痢”等范畴。本病虽然有寒、热、虚、实之别，但始终存在着脾失健运、湿热蕴肠、气血淤滞、内疡形成的病理机制。本虚标实、虚实夹杂、正虚邪恋为其主要病机特点。据此，我们谨守病机，确立了健脾益气以固本，清解化湿以治标，结合调气行血及局部祛腐生肌的治疗大法。口服方中黄芪健脾益气，托毒生肌;白术益气健脾助中州之运，苦温燥湿祛肠胃之湿;二药合用，补虚安中，健脾益气以复脾之运化，共为君药。黄连清热燥湿，厚肠止利，为治痢之要药;地榆功擅凉血止血，与黄连相伍，既能清化胃肠湿热又能斡旋阳明胃腑与大肠之气机;地榆炒炭止血之力倍增;方中木香善行胃肠之气滞，为治泻痢后重必用之品;与黄芪、白术相伍又有“补而不滞之妙”。当归补血活血，与木香相伍，更有“调气则后重自除”，“行血则便脓自愈”之理。白芍柔肝缓急止痛，麸炒则更入中焦。配少量防风取其升散肠风之性，并与术、芍相伍，能舒肝醒脾且为脾经引经之药。甘草与白芍相使为用，以缓急止痛，又能调和诸药兼司佐使之职。灌肠方中败酱草解毒消痈，祛淤排脓;三七既能止血，又能散淤，止血而不留淤;白及收敛止血，消肿生肌，与三七相伍去腐生肌、敛溃而不留邪。四药针对主要病因——湿热以及局部病理变化——痈疡而设，所以共施君臣之职。儿茶收湿敛疮，生肌止血;枯矾燥湿、解毒、止泻、止血，二者共为佐使。全方药少力专，保留灌肠直达病所，起到解毒消痈、收敛止血、活血化淤、祛腐生新的功效。总之，采用中药口服加灌肠，内外合治、整体调理与局部治疗相结合的方法，不仅符合本病之病因病机，也体现了辨病与辨证相结合的治疗原则。

本研究从药效学角度进一步探讨了安肠愈疡汤合加味生肌散治疗溃疡性结肠炎的作用机制。实验结果显示，安肠愈疡汤合加味生肌散不仅对二甲苯所致小鼠耳肿胀有较好的抑制作用，而且对热刺激等引起的疼痛反应也具有明显抑制作用，且其抗炎、镇痛作用优于两方分别单用的效果。

MPO是中性粒细胞中含量较高的一种酶，其含量的增高可以反映中性粒细胞在某一组织中的增高，间接反映炎性细胞的浸润程度[7]。本研究显示，经安肠愈疡汤合加味生肌散治疗后，UC大鼠结肠大体形态、组织病理学改变以及结肠组织MPO检测结果均有明显的改善，与单纯内服与单纯外用的疗效有统计学差异，提示安肠愈疡汤与加味生肌散合用具有更好的抗炎和促进溃疡修复的作用。

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