液相色谱-飞行时间质谱法快速鉴定紫苏叶中的化学成分

紫苏系唇形科紫苏属一年生草本植物,是我国传统的药食两角植物[l]。传统中医药实践中,紫苏种子作紫苏子使用,具有降气、消痰平喘、润肠的功效;紫苏叶具有解表散寒、宣肺化痰、行气和中的功效;紫苏梗具有理气宽中、安胎和血的功效[2]。因其疗效确切,2010年版《中华人民共和国药典》将其收载。药理研究表明,紫苏提取物具有免疫调节、抗菌、抗病毒、镇静、解热、镇痛、抗炎、抗过敏等药理活性。紫苏除作为药用外,因其富含的挥发油具有特异香味,可作为蔬菜食用,是我国卫生部首批颁布的药食同源的常用中药[3-4]。作为药食两用的植物,其多种药理活性已被人们认识,相应的化学成分研究有较多开展[5-6]。但不同产地以及收获季节与储存运输中也有可能发生化学成分变化,从而导致药理作用的变化。因此有必要开发一种快速有效的方法对紫苏中化学成分进行鉴别。笔者采用高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术,对紫苏叶提取物进行了较系统的快速分析,为紫苏的开发与利用提供了一定的实验数据。

1材料与方法

1.1仪器与试药高效液相色谱-飞行时间质谱系统中高效液相色谱仪为A要lent1200系统,由在线脱气单元、四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器等部件组成;飞行时间质谱仪为质谱仪,配各Apollo电喷雾离子源。经色谱分离的样品洗脱液经三通分流.95%洗脱液进人高效液相色谱的二极管阵列检测器采集紫外可见光谱分析,5%洗脱液经BNMI泵进人质谱离子源进行质谱检测。乙腈为HPLC级(J。T。Baker公司),水为millipore纯水仪制各。甲酸为分析纯(国药集团上海试剂集团)。紫苏样品经鉴定为正品紫苏。

1.2色谱条件色谱柱:ACE⑧C18(250mm×4.6mm,5um)。色谱梯度洗脱溶剂由A相(0,1%甲酸水溶液)与B相(乙腈)组成,0-70min;B:5%-85%。流速为1mL·minl。柱温为30℃。紫外检测波长为咒0nm。

1.3质谱条件质谱以负离子模式采集数据,电喷雾离子源干燥气温度为2O0℃,干燥器流量为8L·min-1,雾化气压力为BO kh,石英毛细管电压为3.2kV,电离挡板电压为5O0V。质谱质量采集范围为50~1600。

1.4样品溶液配制称取粉碎的紫苏样品0.5g,加入到装有50%乙腈水溶液2mL的EP管中,超声提取5min。提取完毕后,在10000r·mh-1(r=125px)转速下离心5min,上清液用孔径0.45um纤维素滤膜滤过,得样品溶液,备用。

2结果

在紫苏提取物的高效液相色谱与飞行时间质谱分析中,在280nmUV谱与J总离子流谱图中(图1),各峰得到较好分离。通过对各色谱峰紫外-可见光谱、准分子离子与碎片离子的高分辨质谱数据进行分析,结合文献中紫苏植物化学研究结果,初步鉴定出20种化学成分(表1),这些化合物从结构类别上看主要为酚酸与黄酮两大类成分。另外还检测出2种未知成分。

2.1酚酸类化合物鉴定在色谱-质谱分析中,保留时间11.10,13.62与14.29min色谱峰的准分子离子峰[M-H]-分别为m/z353.O890,353.O867与353.0883,同时,这3种化合物紫外可见光谱最大吸收波长相近,推测三者为同分异构体。由准分子离子精确质量推测化合物分子式可能为C16H1:09,3种化合物的区别在于其特征碎片离子m/z191.0.60,179与173.0449强度上差别,结合文献[18]推测三化合物分别为3-咖啡酰奎宁酸、5-咖啡酰奎宁酸、⒋咖啡酰奎宁酸。在紫苏提取物280nm色谱图中,最强色谱峰保留时间为2.79min,其准分子离子峰[MH]-m乃359.0772,同时还可观察到二聚体离子峰[2MH]-719.1629,及其碎片离子m分别为197.⒄53,179.0364与161.u34。这是典型的迷迭香酸的质谱特征,因此推测此化合物为迷迭香酸[18]。在色谱保留时间76min,检测到质谱峰719.14,其一级质谱中仅较弱碎片离子峰渤359.0768。此化合物的二级质谱中,观察到碎片离子掘,197.51,179.O53与161.31。这些碎片离子质量表明此化合物与迷迭香酸有相似的结构特征,故推测此化合物可能为咖啡酸四聚体类化合物或迷迭香酸二聚体。具有此特征的咖啡酸四聚体类化合物未见文献报道,因此有可能为新化合物,但其结构有待进一步结合磁共振技术进行结构鉴定。

2.2黄酮类化合物鉴定黄酮类化合物质谱特征较为明确,通过对这些化合物精确质量及其紫外数据分析,可初步鉴定出木樨草素⒎氧-葡萄糖苷、木樨草素⒎氧-葡萄糖醛酸苷、芹菜素刁-氧-葡萄糖苷与芹菜素⒎氧-葡萄糖醛酸苷等化合物。

保留时间16.53与16.97min色谱峰的准分子离子峰[M-H]-分别为m/z637.1044与637.1035,由精确质量推测化学式为C27H2501:,其理论值为637.1046。此外,一级质谱中还可观察到较高丰度的碎片离子351.0569(化学式CH012,理论精确质量35.69)。两化合物二级质谱中检测到掘乃2.0408与205.02,两碎片离子精确质量推测碎片化学式为C15H906,推测为四羟基黄酮。在紫苏植物化学成分研究文献[8,14]中,野黄芩素-氧-二葡萄糖醛酸苷、木樨草素7氧-二葡萄糖醛酸苷两化合物分子式为C27-501:,但这两化合物并无参考质谱数据与本研究中两化合物进行比较,因此仅质谱数据难以确认本研究中两化合物具体结构。本研究中两黄酮化合物在紫外光谱中最大吸收波长有明显差别,而已知黄酮化合物中不同羟基取代位置上的差别直接影响到紫外光谱数据的差别,进一步结合文献比较,确定两化合物分别为野黄芩素⒎氧-二葡萄糖醛酸苷、木樨草素⒎氧-二葡萄糖醛酸苷。

保留时间19.O5 min色谱峰的准分子离子峰[M-H]-为m/z621.1082,由精确质量推测的化学式为C27H25017,其理论值为621.1097。此化合物一级质谱中可检测到碎片离子351.0565,二级质谱中检测到碎片离子m/z269.0451。结合文献[8,14],推测此化合物为芹菜素⒎氧-二葡萄糖醛酸苷。

以上3个黄酮二葡萄糖醛酸苷类的一级质谱中并未检测到高强度的黄酮苷元离子,而检测到较高碎片离子m/z351.0569,由其质量推测的化学式为C12H15 012,表明此片段为二葡萄糖醛酸离子。此碎片离子强度较高,估计与其结构中羧基易失去质子离子化有关。

2.3茉莉酸及其糖苷的鉴定在紫苏提取物色谱分析中,在18min检测到离子m/z225.1123,由其精确质量推测此化合物分子式为C12H1:04,具有此分子式的化合物茉莉酸曾在紫苏中分离得到[13],因此鉴定此化合物为茉莉酸。在15.65min检测到离子I,由其精确质量推测此化合物分子式为C18H809,具有此分子式的化合物茉莉酸5-氧-葡萄糖苷曾在紫苏中分离得到[8],因此初步鉴定此化合物为茉莉酸5-氧-葡萄糖苷。茉莉酸与其糖苷为一种植物激素,主要应对抵御植物外来侵害的产生应激。茉莉酸类化合物在紫苏中的发现,提示在紫苏的开发利用中,需考虑植物生长环境的差别,可能会导致紫苏药理活性强度上的差异。

2.4其他类化合物本研究对紫苏提取物的高效液相色谱-飞行时间质谱分析中还鉴定出柠檬酸与丹参素等小分子化合物,这些化学成分与植物的生长有一定关系。在质谱数据分析中还检测到一些未知离子m/z417.1421,由精确质量推测其分子式C18H6011而具有此分子式的化合物尚未在紫苏植物中未见文献报道,提示目前紫苏中化学成分的研究还有待进一步深人。

3讨论

本研究采用高效液相色谱-飞行时间质谱联用法技术,通过二极管阵列检测器得到的紫外数据与高分辨质谱数据的结合分析,从紫苏提取物中初步鉴定出20种化学成分。这些鉴定出的成分主要为酚酸与黄酮类化合物,其中对羟基肉桂酰葡萄糖苷、3-咖啡酰奎宁酸、5-咖啡酰奎宁酸、4-咖啡酰奎宁酸为采用质谱技术首次从紫苏中鉴定出的已知化合物。在黄酮类成分的质谱鉴定中,鉴定出3种含量较高的黄酮二葡萄糖醛酸苷类化合物。这类化合物的一级质谱中,检测到较高强度的二葡萄糖醛酸碎片离子m/z351.O569,而仅检测到极弱的黄酮苷元碎片离子,因此提示此离子可能为黄酮二葡萄糖醛酸苷类化合物在负离子模式下的特征碎片离子。中药材成分复杂,药材植物与产地、季节等自然因素有关,在药材采集储运等环节还存在着影响药材化学成分变化的素。紫苏在世界范围内作为药食两用的植物药材,化学成分的变化必然会影响到其药理活性与食用价值的差别,因此在大规模地开发利用之前,有必要对其化学成分作进一步了解。本研究建立一种基于高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术用于紫苏叶提取物中化学成分快速分离与结构鉴定的方法,可为该植物的利用与开发提供参考数据。

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