骨髓间质干细胞与心脏病的治疗

　　作者：郑敏 作者单位：咸宁学院药学院药理学教研室， 湖北 咸宁 437100

　　【关键词】 心血管疾病

　　心血管疾病导致的心功能障碍广泛分布并为成人发病率和死亡率增加的重要因素。一般认为，机体缺少心肌修复和再生的有效的内在机制，心肌细胞无增殖分化能力，受损后不能再生，只能由成纤维细胞填充，最终为瘢痕组织替代，并逐步发生心室重构形成慢性心力衰竭。传统的药物、介入治疗等虽然保护了心功能，患者生活质量亦提高，但并不能从根本上逆转心血管疾病引起的心肌细胞数量减少;心脏移植则由于供体来源少、风险大、排斥反应等难以广泛开展。干细胞移植有可能取代受损心肌细胞，增加有功能的心肌细胞数量，并建立新的血管来供应血运，为心肌梗死(MI)的治疗开辟了一条新途径。骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)是存在于骨髓中的非造血干细胞，具有来源广、取材方便、免疫原性低、易于分离和体外培养扩增、易于外源基因的导入和表达、可进行基因修饰、能分化为心肌细胞和内皮细胞等优势，成为心血管疾病细胞移植治疗的理想种子细胞。

　　1 BMSC向心血管组织细胞分化

　　大量实验数据表明，BMSC一旦暴露于多种生理或非生理性刺激下，进一步分化的细胞显示心肌样细胞的几种特征。在这些条件下，体外分化的BMSC 显示出肌管样结构和时间依赖性同步跳动特性;电子显微镜分析揭示这些细胞具有心肌细胞样超微结构包括典型的肌小节，中心位核和心房颗粒;并呈现发育心肌细胞的几种功能特征包括肽类物质的产生、多重结构收缩性蛋白的表达;它们也显示出至少具有窦房结样和心室样细胞兴奋能力[1-3]。

　　已明确介质和直接的细胞与细胞之间的接触均可诱导BMSC分化为心肌细胞。通过与人类心肌细胞共培养，已经证实干细胞可以获得心肌细胞样的表型特征为表达重链肌球蛋白、βactin及肌钙蛋白T。然而，当BMSC在心肌细胞条件培养基下培养时，仅能观察到βactin 表达。因此，细胞与细胞之间的直接接触对于促使BMSC分化为心肌细胞基因谱系的心肌环境或微环境的信号传递是必须的。而且，人BMSC呈现出细胞与细胞之间的相互偶联并通过特殊的缝隙连接与心室肌细胞偶联[4，5]。实验观察到培养的心房和心室肌心肌细胞与从BMSC分化而来的心肌细胞样细胞具有惊人的细胞及分子相似性，为更好地理解原始成体细胞和BMSC源性心肌细胞之间的细胞对话迈出了重要的一步。已证实BMSC不仅可分化为心肌细胞，同时还可以分化为血管平滑肌细胞或其前提细胞(vSMC/PC)、祖细胞和内皮细胞。这些细胞类型均与血管系统发生有关，包括血管的生成和扩张。研究表明，新vSMC/PC形成出现在血管周围间质干细胞分化后，呈现血小板源性生长因子B(PDGFB)依赖性过程; 随后又发现, 在心肌内注射BMSC 后，组织病理学和免疫组织化学分析揭示注入的细胞分化为心肌细胞、vSMC/PC 和内皮细胞，同时可观察到血管密度的增加[6]。与此相似，给慢性缺血的狗心肌内注射BMSC可产生血管供应增加的效应并改善心功能。免疫荧光分析揭示，内皮细胞和平滑肌细胞出现共区域化，与肌细胞却不存在共区域[7]。因此，这些数据表明BMSC成为心梗后病人大量心血管组织细胞成分的一个理想的供体来源。BMSC分化为心肌细胞继发新生血管形成和心功能改善的机制与BMSC引起的生长因子的旁分泌有关[8-10]。已经证实，FGF2，一种主要的有丝分裂蛋白，是由BMSC产生，并分别刺激定型和未定型的BMSC持续休眠和增值[11]。未定型的BMSC代表休眠前体的少数细胞群，而定型和成熟的BMSC产生大量的终末分化的间质细胞系[12]。

　　以上阐述BMSC 具有分化为几种心脏表型细胞的潜能，多数情况是根据冰冻组织样本的免疫组织学分析显示固定细胞的细胞系的特殊细胞标志的共区域化的实验依据为基础。到目前为止，还没有证实BMSC 注入后在受体心脏检测到的已明确的免疫表型是肌原性和(或)血管细胞系分化的真正显示且不是假象。在骨髓干细胞可塑性研究方法学进一步发展后，相似的观点已引起广泛争议。因此，目前有必要借助一种合适的可确保实验结果准确、可重复及稳定的方法学检测进行BMSC分化为心肌细胞的研究。此将有助于避免不必要的争议诸如骨髓造血干细胞横向分化为心脏表型细胞继而影响心肌再生[13，14]。

　　2  临床前研究

　　啮齿动物如羊、狗、猪或猴梗死模型的实验研究表明，多种类型细胞进行心脏移植是可行的且有助于改善梗死心肌的收缩功能[15]。这些细胞类型包括自体同源的未纯化的骨髓、骨髓单核细胞、纯化的骨髓来源的细胞(CD34+ 和(或) CD113+)、心肌细胞、成纤维细胞和肌原细胞。虽然可以变更移植方法(经心肌内、冠状动脉内或静脉)、移植细胞的数量和受体的心脏状态，但移植后的免疫或毒性反应仍然不能检测。

　　BMSC也已被认为是心脏疾病细胞治疗的潜在的备选细胞。BMSC移植的有效效应取决于它们具有呈时间依赖性和特殊的组织亲和性的方式植入受体组织。由于心脏组织是BMSC最先的目的地，因而提出BMSC注入可能在心梗后重塑、血管发生及瘢痕形成的病理生理过程中起很重要的作用。 关于这一点, 临床前研究数据证实冠状动脉内或心肌内注入后，移植的 BMSC 继续存在于心肌内并经过微环境依赖性的心肌基因型分化;移植入的细胞显示心肌细胞表面标志物的重新表达，诸如β肌球蛋白重链、α肌动蛋白、心脏肌钙蛋白T和受磷蛋白。而且，移植细胞发育为含纹状肌原纤维肌球蛋白重链的肌纤维及细胞与细胞之间的结点[16，17]。

　　由于猪和人的心脏解剖结构相似，因而用作MI和全身心血管疾病研究的模型。 应用此模型, 可以获取到注入的BMSC进入正常和梗死的心肌组织的轨迹和短暂及长期移植的心脏效应的有价值的信息。借助于磁共振荧光透视检查技术，研究者们已经确定梗死和正常组织界限的标志性区域，指导心肌内BMSC注射。除此以外，正常和梗死的心肌组织内注入的铁荧光粒子标记的BMSC在移植后跳动心脏已获许检测[18，19]。应用猪的这种模型，已确定心肌内移植后2周标记的BMSC的有效移植已经出现并伴几种肌特殊蛋白的共表达。这种现象意味着BMSC随之分化为心肌样细胞，2周后伴随收缩功能不良的显著缓解，同时，心肌壁变薄显著减轻。在心肌重塑期间，一个重要的问题是与细胞再生安全可行的程序的优化有关。应用大动物模型(如羊、狗、猪)，大多数研究者证明心肌内注入祖细胞到梗死区域是安全和可行的。在猪模型上进行的有关BMSC的实验，心肌内注入细胞(104～108)被证实是安全的而且没有检测到免疫和其他的毒性反应[18，19]。心肌内注入BMSC操作的安全性的进一步证据在犬慢性缺血模型上得到证实[6]。证实犬接受心肌内注入BMSC(总细胞数为1 ×108) 存活阶段无并发症且未显示心率失常、心脏STT 波变化或Q波起始变化等体征。而且，由于心肌激酶(CK)MB 和肌钙蛋白 I 水平在最初的轻度上升后又下降到基础水平，心肌损害亦可除外，组织病理学分析也显示无MI存在。 然而，心肌内注入BMSC 的安全性已经受到挑战。最近的研究揭示正常犬冠脉动脉内注入犬BMSC(10 ×106)后出现急性心肌缺血和亚急性心肌微梗死[20];这些进一步的心脏变化发生的原发损害是由于大量(18～20μl) BMSC 引起的血管阻塞导致的缺血状态所致。 由于此项颇有影响的研究不包括插入导管但未接受细胞移植的对照组犬，因而很难确定是细胞大小、导管插入术本身还是其他因素[21]是引起心肌缺血和微梗死的器质性始动因素。有关冠状动脉内注入干细胞的安全性和有效性，Wollert’s 研究结果则得出与成长期个体包括人体研究相反的结论[22]。

　　这些临床前试验在MI病人上可能产生的影响难以估计。从操作安全性看，任何人均可假定在猪身上进行的研究所获得的安全性数据都可能与人相关。然而，毫无疑问的是，有必要进行更多的研究[23]。从功效看，结果显示BMSC时间依赖性的贮留、移植、迁移和分化，强化了MSC移植是缺血性心力衰竭的一种替代治疗的观念。

　　3  临床研究

　　近几年，开始了几项临床研究以评定急性MI后移植自体细胞在心肌再生方面的影响。大部分研究中修复细胞来源为异体骨髓细胞成分，命名为骨髓源性单核细胞(BMMNCs)。BMMNCs至少包含几种细胞亚群：淋巴细胞、早期骨髓细胞、内皮原始细胞及极低含量的造血干细胞和或BMSC。除了该种来源的修复细胞外，骨髓细胞的大多数纯化成分如含CD34+或CD133+表面标记的原始细胞及骨肌原细胞也被用于严重的心梗后左心室机能障碍。在所有上述这些研究中，自体修复细胞通过冠状动脉内、心肌内或经心外膜途径施于。结果表明，从恢复梗死心肌灌注率方面而言，植入操作是安全、可行和有效的[22，24]，后者大多数情况归因于BMMNCs中存在的内皮原始祖细胞[25]和或分泌的血管源性生长因子引起的血管事件[26-28]。虽然在动物模型中积累了大量关于BMSC分化和应用的信息，但在心肌梗死的病人中进行评定心脏功能效应的临床试验仍然很少。

　　最近，Chen 等[29]组织进行了一项随机性研究以观察急性MI病人冠脉内注入BMSC 后的效应。在梗塞形成相关的冠状动脉阻塞后，自体BMSC混悬液通过附有金属丝的可膨胀的气囊式导管直接注入目标冠状动脉。心动描记值显示接受BMSC 治疗组与对照组有显著差异。治疗组病人运动功能减退、运动不能及运动障碍百分率下降，心梗区周围心室壁的运动速率和左心室射血分数显著提高。Chen 等[29]报告证明总的左室射血分数显著和持续提高，其强度甚至大于注入造血细胞后，表明MSC的注入在人心脏触发了新的心肌细胞形成和新血管发生[16]。另外，证实冠脉内注入BMSC 不会产生任何以前所报道的细胞大小相关的不良反应[20,30]。在一项前瞻性非随机化Ⅰ期临床试验中，评定了冠脉搭桥术(CABG)病人心肌内注入自体BMSC 和 MNCs混合物的可行性、安全性和有效性。患MI及因持续缺血宜作CABG术的病人纳入本研究范畴。骨髓从研究组病人中抽取并且处理用于分离和扩增BMSC。第二次的骨髓抽取于手术当天(研究组)并用于制备MNCs。一旦所有的冠状动脉动脉旁路吻合完成，BMSC 和MNCs的混合物即沿着梗死边缘四周注入。所有病人在此操作程序后都存活下来并且没有出现手术并发症。注入细胞后，血清标记物的突然增高并未检测到。手术后4个月，心脏磁共振影像学分析揭示接受细胞注入治疗的患者总的左室射血分数较基础值及对照组病人增加。而且，细胞治疗的病人MI体积显著减小。虽然研究的病人有限而且从细胞移植效应中分离出手术效应也很复杂，但是这些结果仍然能够表明注入自体的BMSC 和BMMNCs的混合物是可行、安全和极其有利的。

　　应用“修复细胞”混合物取代单一细胞类型的原理在于以下的依据。首先， BMMNCs 是内皮祖细胞的一个重要来源[25]。临床数据表明植入MNCs于MI和四肢缺血病人后，可有效促进治疗性血管新生。其二，正如前面阐述， BMSC 具有分化为心肌细胞样细胞的潜能。其三， BMSC 产生血管生成性生长因子如成纤维母细胞生长因子，血管内皮生长因子和干细胞归巢因子[11,31]。因此，BMSC 和 MNCs的共同移植可能产生心肌再生和血管再生二者同时增强的效果。 心肌内共同移植BMSC合并其它细胞并非没有先例;研究结果显示心肌内移植BMSC合并胚胎心肌细胞或骨髓细胞引起心肌再生的显著增加,可能缘于触发了与新心肌发生和新血管发生和(或)神经芽殖及前房交感神经分布过多的细胞和分子事件。

　　4  问题和展望

　　目前认为BMSC治疗心血管疾病的机制主要有[32,33]：① BMSC能够分化为心肌细胞，修复坏死心肌; ②BMSC分化为内皮细胞，促进血管再生，重建梗死部位的血运，增加缺血区的灌注，减少梗死范围;③ BMSC的旁分泌作用，BMSC能分泌多种细胞因子，如单核细胞趋化蛋白、VEGF、成纤维细胞生长因子2、白细胞介素(IL)、血管生成素等，而上述因子已被证实有促进血管内皮细胞和平滑肌细胞增殖，发挥促血管增殖的作用;④BMSC的其它作用。如植入的BMSC能够下调梗死心肌I型胶原酶、Ⅲ型胶原酶、基质金属蛋白酶抑制剂的表达，调节梗死局部胶原代谢，促进胶原降解，减少胶原沉积，从而减轻梗死区瘢痕的硬度及心肌纤维化程度，抑制心室扩张和梗死后心室重构，改善心功能;植入的BMSC在心肌细胞的微环境中，与邻近的心肌细胞产生电机械偶联，与宿主心肌发生同步收缩。⑤BMSC作为基因治疗的载体，转入功能基因治疗心血管疾病。

　　尽管基础和临床研究从不同的角度及其作用机制显示出BMSC治疗心肌梗死的潜能;然而，BMSC心血管疾病移植治疗还有许多尚未解决的问题及争议[32，34，35]：①至今尚无特异的BMSC标记物以供分离鉴定;目前分离得到的只是一个杂合细胞群。确定BMSC的特异性分子标记，寻找最适合细胞移植治疗心血管疾病的亚群仍有待更进一步的探索。② MSCs能否分化为成熟的心肌细胞与宿主心肌细胞形成功能上的合胞体达到生理上的再生修复;③MSCs移植对心肌梗死后电重构的影响研究不多，以至尚未明确MSCs是否具有改善心肌梗死后心律失常的作用，拟或增加心律失常的发生。④ 临床适应证。⑤移植治疗的最佳时机、细胞数量和浓度、移植途径及移植存活分化的机制。⑥远期疗效及安全性，异基因的MSCs在梗死心肌内可以存活6个月并且表达心肌特异性标记物，在第4周时可以观察到实验组比对照组左室功能明显改善。但是这种效应是短暂的，到6个月时此效应消失。⑦目前常用的心肌缺血模型多为结扎或栓塞冠状动脉或心肌冷冻损伤，在一定程度上模拟了心肌梗死，但与冠状动脉粥样硬化的病理状态还存在一定差异，更接近动脉硬化的心肌梗死模型有待进一步探讨。⑧临床研究中移植细胞的示踪问题和分化鉴定问题，动物实验应用的标记物常对供体细胞和受体都有一定毒性，因此必须寻找对人体既无损害，又便于跟踪的细胞标记物。⑨移植细胞能否在心肌梗死后数周或数月形成的瘢痕区域而不是仅在丧失血流后数小时的缺血区域再定居繁殖。

　　纵观目前研究，BMSC移植治疗心血管疾病具有良好的应用前景，结合基因治疗将可进一步提高疗效。随着各种实验技术的发展，多学科的交叉渗透研究，BMSC面临的问题将不断得以解决，其治疗作用和不良反应必将不断地被人们所掌握。

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