内皮型一氧化氮合酶转基因治疗心血管疾病研究现状

    　作者：红梅 付军 迟宝荣 作者单位：(吉林大学第一医院，吉林 长春 130021)

　　【关键词】 内皮型一氧化氮合酶;一氧化氮;基因转移;基因治疗;心血管疾病

　　研究证明许多心血管疾病如动脉粥样硬化(AS)、血管再狭窄、高血压、冠心病、脑血管疾病等的发生发展与一氧化氮合酶/一氧化氮(NOS/NO)的功能异常有着密切关系〔1〕。因此，重建NOS/NO系统功能成为治疗心血管疾病的策略之一。但直接给予NO因半衰期短、易产生耐受性、副作用明显等使其在临床应用受到限制。NOS基因转移无疑为解决这一难题提供了新的思路和方法。NOS有3种同工酶，尽管均可产生NO，但其产生条件、作用靶器官和所发挥的作用仍有所侧重。因为内皮型一氧化氮合酶(eNOS)在血管壁中起着重要作用，学者将eNOS作为心血管疾病基因治疗的首选酶〔1〕，本文就eNOS转基因治疗心脏及血管疾病的研究现状作一综述。

　　1 NO及eNOS

　　NO是由L精氨酸经NOS催化产生。人类NOS有三个亚型，即神经元型(nNOS)、诱导型(iNOS)、内皮型eNOS，eNOS 和nNOS主要存在于内皮细胞和神经元，是Ca2+/钙调蛋白(CaM)依赖性的酶;iNOS由巨噬细胞等多种细胞产生，是Ca2+/CaM非依赖性的酶〔1〕。在生理水平，eNOS和nNOS保持着低程度的活化度，维持着内环境自稳，而iNOS能诱导产生大量NO，这常常会导致病理损伤〔2〕。在内皮细胞eNOS通过催化产生NO起到抑制血小板聚集、血小板和单核细胞血管内皮黏附、血管平滑肌细胞增生、低密度脂蛋白氧化、黏附分子表达和内皮素生产等多种调节作用影响心血管稳态〔1〕。体内eNOS受遗传和环境因素的调节，其活性需多种因素的参与和调控，如L精氨酸、辅助因子四氢生物喋呤(BH4)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、CaM、G蛋白偶联受体、热休克蛋白90、小窝蛋白、一氧化氮合酶相互作用蛋白、发动蛋白2、磷酸化和去磷酸化以及阴离子磷脂等因素的调节〔1〕。在多种心血管疾病eNOS基因表达发生改变〔3〕，导致NOS/NO系统，因此，通过eNOS转基因技术恢复NO的生成,无疑对心血管疾病的治疗具有重要意义。

　　2 动脉粥样硬化(AS)

　　NO发挥多种血管保护作用，包括血管舒张，抑制血小板聚集和内皮细胞黏附，抑制平滑肌细胞增殖等〔1〕。MujynyaLudunge等〔4〕给具有AS倾向的载脂蛋白E缺陷(ApoE(/)型小鼠转移腺病毒介导的eNOS基因，可修复受损颈动脉内皮依赖性血管舒张功能，转染5 w后病损面积减少，内膜/中膜比值降低，巨噬细胞浸润减少，有效抑制了血管病变的形成和发展。Hayashi等〔5〕对AS家兔进行eNOS基因转移，7 d后AS病变消退。Tanner〔6〕等研究人AS颈动脉体外转移eNOS基因是否能增强NO产生，用非AS人胸廓内动脉及大鼠主动脉作对照，结果颈动脉髙效表达eNOS蛋白，但不增加NO释放，相反，eNOS基因增强非AS动脉NO产量，而且发现eNOS基因转移的颈动脉钙依赖性eNOS活性极低，与对照组比较无明显差异，各组间BH4浓度也无差别。补充各种辅助因子及超氧化物歧化酶、PEG过氧化氢酶等均未改变NO释放量。提示eNOS基因虽然在人AS颈动脉得到高表达，但其活性并未增加，而这种缺陷既不是由辅助因子缺乏造成，也不是因NO代谢增强所致。所以，有充分的理由将这种差别解释为在不同的动物模型和人体组织、以及不同性别、不同程度和/或不同发病机制造成的AS会导致重组eNOS蛋白的活性不同，表明转基因在人体不同组织可能产生意想不到的结果，因此，在开始临床试验之前，应该完成相关组织的体外研究。

　　3 血管再狭窄

　　移植静脉再狭窄是影响冠状动脉旁路移植术(CABG)后远期疗效的主要因素。许多研究表明，CABG术后血管桥再狭窄的发生与NO的功能异常相关。移植血管再狭窄主要是由于血管平滑肌细胞过度增生和凋亡失去平衡，形成新内膜和不断发展的血管粥样硬化所致。移植血管转染eNOS基因通过抑制血管平滑肌细胞增生，促进其凋亡，使移植静脉内膜和中膜增生减轻，从而能有效防治移植血管再狭窄〔7～9〕。

　　李铁岭等〔7〕制作自体颈静脉腹主动脉移植大鼠模型，移植前分别将血管浸泡于携带eNOS基因的腺病毒溶液和腺病毒空载体溶液。移植术后2 w取出血管发现eNOS转染组内膜厚度、管腔狭窄度、内膜血管平滑肌细胞数及PCNA阳性表达均较对照组明显减小或减少，而eNOS mRNA表达则明显增加。陶登顺等〔8〕的同类研究进一步证明移植血管内膜/中膜厚度比值也减少。陶登顺等〔9〕通过腺病毒介导的人类eNOS基因体外转染人桡动脉，体外培养14 d后发现eNOS转染组内膜厚度及内膜/中膜比值低于对照组，在内膜和中膜可检测到eNOS的mRNA和蛋白表达，结果有效防治了桡动脉内膜增生。

　　4 心肌梗死

　　NO通过拮抗血管紧张素Ⅱ的作用在心肌缺血后心肌肥厚和纤维化反应的调节中发挥重要作用。eNOS基因转移后eNOS/NO系统通过抑制氧化应激介导的信号通路，减轻心肌梗死后心肌重塑和心肌细胞凋亡，刺激新生血管形成，并抑制转化生长因子beta1/Smad2信号途径对心肌梗死后心脏损伤起到保护作用〔10，11〕。

　　Robert等〔10〕将腺病毒介导的eNOS基因(AdCMVeNOS)经尾静脉注入心肌梗死模型大鼠，6 w后eNOS导入组与对照组(荧光蛋白基因)比较左室舒张末压、心脏重量、左心室长轴和梗死面积明显减少，胶原蛋白和TUNEL阳性凋亡细胞减少，这种NO的保护作用伴随NADH和NADPH氧化酶活性减低和超氧化物的生成减少，同时转化生长因子β1和p27水平、JNK活性、NFκB核转运和caspase3活性均减低。Chen等〔11〕在左冠状动脉前降支结扎术前4 d将AdCMVeNOS转入大鼠心脏局部，心梗后24 h发现eNOS转染使心肌梗死面积和心肌细胞凋亡显著减少，心室收缩和舒张功能得到明显改善。而转化生长因子β1的活化及Smad2蛋白的表达则下降。在心肌梗死后第7天转染eNOS组左室重构及其收缩和舒张功能的恶化得到明显控制，毛细血管密度和α平滑肌肌动蛋白增加。eNOS对心脏的上述影响都被L硝基精氨酸甲酯(LNAME)所抑制，这表明这些作用是由NO介导的。

　　5 慢性心功能不全

　　2001年Paulus等〔12〕综述了近几年来的研究，初步肯定了以下研究结果：eNOS/NO可缩短心肌的收缩期，增强心室舒张效应，降低左室前负荷和心肌氧耗，防止钙泵依赖的ATP酶下调，对衰竭心肌具有保护作用。eNOS基因表达愈低的病人左心室搏功愈少，心功能分级愈高。在衰竭心中增加eNOS基因表达对心衰有益。Maeda等〔13〕在新生大鼠心肌细胞转染AAV介导的eNOS基因后,检测到eNOS蛋白表达，eNOS升高显著增加心肌内cGMP和硝酸盐/亚硝酸盐含量，明显抑制α肾上腺素激动剂刺激下的心肌蛋白合成，显示了其在慢性心功能不全中心肌肥厚的治疗效应。Ren等〔14〕采用重组腺病毒携带eNOS基因体外转染成年大鼠心室肌细胞，转染36 h后发现eNOS转移能提高心肌细胞eNOS表达和活性，明显增加心肌细胞缩短/舒张幅值以及速度，并升高基础和电刺激引起的细胞内Ca2+水平。而eNOS诱导的机械效应与Akt磷酸化水平升高呈平行关系。此外，磷脂酰肌醇3激酶抑制剂渥曼青霉素和LY294002可防止eNOS诱导的机械效应。这些结果表明，基因转移eNOS直接促进心肌收缩功能和心肌细胞内Ca2+转运，暗示了其在逆转慢性心功能不全中的潜在治疗作用。

　　6 高血压

　　大量研究证明eNOS活性降低，NO生成减少是血压升高的重要原因。eNOS基因的导入能提高血浆NO水平，能长期降压、下调AT1R的表达、减少交感神经系统和肾素血管紧张素系统活性、改善胰岛素抵抗、提高患者的胰岛素敏感性，并能延缓心脏、肾脏及血管等高血压靶器官病理损害进程〔15～18〕。

　　宋铁山等〔15〕给高盐诱导高血压大鼠尾静脉注射eNOS cDNA重组质粒后第7天血压明显下降达6.2 mmHg，最大降压效应达到15.4 mmHg，尿微量白蛋白显著下降，并下调AT1R的表达。提示eNOS基因的导入为临床应用eNOS基因治疗并发肾功能损害的原发性高血压提供了可能。詹昌德等〔16〕的研究表明压力超负荷心肌肥厚大鼠左心室肌NO含量下降，补充内源性NO可拮抗心肌肥厚,可能是通过L精氨酸NO途径而非cGMP途径发挥作用。另外在果糖诱导高血压〔17〕、冷诱导高血压〔18〕和两肾一夹高血压〔19〕等不同高血压动物模型转移eNOS基因后均能不同程度降低血压，降压效应持续数周不等。检测发现eNOS基因转移使果糖诱导高血压大鼠血胰岛素水平明显下降〔17〕;使冷诱导高血压大鼠血浆去甲肾上腺素和肾素活性降低〔18〕;而在两肾一夹高血压小鼠则发现eNOS过表达不仅能够控制血压升高，而且不引起其他心血管功能障碍〔19〕。

　　7 脑血管痉挛

　　蛛网膜下腔出血后脑动脉痉挛具有极大的潜在危害。Khurana等〔20〕将腺病毒包装的eNOS注射于实验犬的脑脊液中，记录0～7d的脑血流图。发现在此期间LacZ转移和未转移组的犬脑基底动脉中点明显痉挛，而在eNOS组则没有。自转移第2天起脑脊液中NO量明显升高，且eNOS转移的犬脑动脉明显扩大缓激肽引起的血管舒张反应，同时内皮素1显著降低。Khurana等〔21〕将eNOS转移至30例人脑软膜动脉，24h即可观察到eNOS表达于外膜成纤维细胞，能明显扩大缓激肽引起的血管舒张反应，LNAME则可引起收缩，并可抑制缓激肽反应。提示eNOS转基因对脑动脉痉挛的治疗潜力。

　　8 肺动脉高压

　　业已证实〔22〕,肺血管床内细胞功能障碍导致NO生成减少，是肺动脉高压(CHPH)发生的病理基础。eNOS转基因治疗使内源性NO含量增加，在不影响全身动脉血压的前提下使肺动脉压力明显降低〔23～25〕。

　　Champion等〔23〕用带有不同启动子的重组腺病毒AdCMVeNOS和AdRSVeNOS经气管吸入转染小鼠肺脏，eNOS的表达分别在转染后1 d和5d到达高峰且分别持续7～14 d和21～28 d。检测发现，eNOS表达小鼠肺动脉压力和肺血管阻力轻度下降，肺血管床压力流量曲线右移。周锦等〔24〕经呼吸道途径用AdCMVceheNOS转染CHPH大鼠，结果证实转基因表达产物具有正常的酶学活性，使内源性NO含量显著增加，肺动脉压力明显降低，全身动脉压并无变化。Zhang等〔25〕在高灌注CHPH模型兔气管内转移AdeNOS后同样观察到肺动脉压力和肺内血管阻力显著下降，钙依赖性L精氨酸和L瓜氨酸转换率及cGMP水平明显提高。而全身动脉压和血管阻力并没有受到影响，分析显示eNOS基因主要在肺小血管内皮细胞表达。

　　9 门静脉高压

　　多种慢性肝脏疾病使肝内阻力增加最终产生门静脉高压(PHT)。肝硬化时由于肝窦内皮细胞损伤使NOS含量、NO产量减少，使ET/NO的动态平衡失调，导致肝内阻力升高和PHT形成。通过eNOS基因治疗可以提高肝内eNOS表达，增加NO的产量，降低肝内阻力和门静脉压力(PVP)〔26，27〕。Zhang等〔26〕以脂质体为载体经门静脉注射eNOS基因至CCl4诱导的肝内型肝硬化大鼠，转基因后5 d肝内eNOS mRNA及蛋白表达和NO产量均明显升高，肝内血管阻力和门静脉压力明显降低。Van de Casteele等〔27〕将AdeNOS基因导入肝硬化大鼠肝内，结果显著增加肝内eNOS的表达，提高NO产量并降低PVP。均提示eNOS基因转移是一种有潜力的治疗PHT的新方法。

　　10 问题与展望

　　基因治疗不仅是一种治疗手段，而且已成为了解一些心血管疾病的重要工具。大量动物实验证明eNOS转基因治疗对血管系统疾病确有效果，但大多数仍处于动物实验向临床应用的过渡阶段，距离广泛应用于临床这一既定目标还很远。主要存在的问题是：①进一步提高基因转染表达系统的安全性、高效性和可控性;②解决目的基因的组织、细胞特异靶向性;③进一步研究心血管疾病特异性或相关性基因，明确适于eNOS基因治疗的合适疾病;④探明eNOS基因治疗的作用机制，明确生理和病理过程中eNOS基因及其蛋白质与其他相关分子相互作用的机制，采取多靶点综合治疗方法提高eNOS基因疗效;⑤成功应用转基因技术治疗心血管疾病需要一个专门的战略，不仅要考虑到转染效率和长期表达，而且还要考虑人体组织器官的生物学特性和疾病发展的病理生理过程，明确动物实验和临床试验的差距，大量增加体外实验，保证基因转移人体后的确切疗效。

　　目前常用的逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒载体都存在一定的缺陷，HIV相关载体是一种高度人源化的人类免疫缺陷病毒，无免疫原性，具备腺病毒和逆转录病毒两者优点，有望成为较理想的载体。非病毒载体途径因其较低的免疫原性、技术简单、安全而逐渐受到重视，成体干细胞是一种有自我更新及多向分化潜能的原始细胞,可以代替病损的心肌细胞,构建新血管,更符合机体生物学特性，易于基因修饰，有可能成为新的转基因工具。目前eNOS基因转染干细胞治疗心血管疾病的研究已有些成效。KankiHorimoto〔28〕等在人工血管内表面覆盖eNOS基因修饰的人骨髓间充质干细胞(eNOS/rMSCs)，结果血管内表面成功表达eNOS重组蛋白，能长期保持血管通畅，表明eNOS/rMSCs转移能有效预防血管移植术后再狭窄和保证其长期自我通畅。基因治疗和细胞移植两者结合可优势互补，可以避免单纯基因治疗的缺陷，相信这一领域的发展可为基因治疗开辟新的路径。

　　心血管疾病的发生、发展是涉及多因素多环节整体调节的复杂过程，常伴有多基因异常。单一基因转移后在转录、翻译及翻译后等多环节受到机体调控，可能会构成更为复杂的网络调节系统。在体内eNOS的活性也受多因素调节，其中BH4是其二聚体化的辅助因子，Cai等〔29〕调查三磷酸鸟苷环化水解酶(GTPCH，合成BH4限速酶)基因转移高血糖人类主动脉内皮细胞(HAEC)后发现GTPCH基因转移升高其NO产量，降低超氧化物生成，而BH4明显增加eNOS二聚体化，在eNOS功能调节中发挥关键作用，提示GTPCH是增加BH4和恢复eNOS活性的一个合理靶点。Crabtree等〔30〕在体外建立的特异性细胞系统中研究eNOS解偶联和BH4的定量关系，结果显示eNOS:BH4化学计量比和细胞内BH4:BH2比率是决定eNOS解偶联、调节其活性的关键因素，所以在基因治疗中不仅要考虑到转染和表达效率问题，而且还要考虑表达产物在人体组织器官的生物学活性和在疾病发展的病理生理过程中经复杂的相互调节作用后最终产生的综合效应，因此，有必要进一步探索能够优化eNOS转基因疗效的综合、多靶点治疗方法，以克服单一基因治疗的缺陷。相信随着心血管疾病分子和细胞水平认识的加深和基因操作工具的发展，eNOS基因治疗的临床应用应具有更广阔的前景。

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