睾酮对衰老心肌细胞及细胞周期调控因子的作用

　　作者：邢晓雯 吴赛珠 阮云军 何天民 刘新强 赖文岩 作者单位：南方医科大学南方医院心内科，广东 广州 510515

　　【摘要】目的 探讨不同剂量睾酮对心肌细胞衰老的干预作用及其可能机制。方法 用1 μmol/L、 100 nmol/L、10 nmol/L三种剂量睾酮干预自然衰老的小鼠心肌细胞，应用流式细胞仪检测各组细胞周期分布，用RTPCR及Western印迹检测各组细胞p16INK4a、cyclinD1 mRNA、蛋白及去磷酸化RB蛋白的表达。结果 与衰老心肌细胞相比，1 μmol/L、100 nmol/L、10 nmol/L睾酮干预细胞G0/G1期比例明显降低(P<0.05)，这一作用具有剂量依赖性。睾酮干预可上调cyclinD1mRNA及蛋白表达，下调p16INK4a mRNA及蛋白表达，并使去磷酸化RB蛋白表达下降(P<0.05)，而这些作用均可被雄激素受体阻断剂而不被雌激素受体阻断剂所阻断(P<0.05)。结论 睾酮可剂量依赖性的抑制小鼠心肌细胞衰老，这一作用部分是通过睾酮上调cyclinD1表达，下调p16INK4a及去磷酸化RB蛋白表达而实现的。

　　【关键词】 衰老;睾酮;RB;cyclinD1;p16INK4a

　　Effect of testosterone on aging myocardial cell and the cell cycle regulation

　　XING XiaoWen, WU SaiZhu, RUAN YunJun, et al.

　　Department of Cardiology, Nanfang Hospital, Nanfang Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong, China

　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of testosterone on the aging myocardial cell and the possible mechanism. Methods 1 μmol/L, 100 and 10 nmol/L testosterone were administrated on natural aging murine myocardial cells, and the distribution of cell cycle was measured by flow cytometry. p16INK4a, cyclinD1 mRNA and protein and dephosphorylation RB protein were detected by RTPCR and Westernblot in each group. Results Compared with the aging myocardial cell, 1 μmol/L, 100 and 10 nmol/L testosterone could diminish the ratio of G0/G1 phase in a dosedependent way (P<0.05). 1 μmol/L, 100 and 10 nmol/L testosterone could induce upregulations of cyclinD1 mRNA and protein, downregulations of p16INK4a mRNA and protein and dephosphorylation RB protein (P<0.05), which could be blocked by flutamide but not ICI182, 780 (P<0.05). Conclusions 1 μmol/L, 100 and 10 nmol/L testosterone can inhibit the senescence of natural aging murine myocardial cell in a dosedependent way, which results from the upregulation of cyclinD1, and downregulations of p16INK4a and dephosphorylation RB.

　　【Key words】Aging; Testosterone; RB; CyclinD1; p16INK4a

　　研究发现，心脏储备功能随增龄而下降，这很大程度上是由心脏衰老引起的〔1〕。心脏衰老使心脏对心肌缺血、收缩压升高等病理状况更为敏感，因此是老年人心衰患病率升高的主要原因之一〔2〕。心肌细胞是心脏主要的功能细胞，衰老的心肌细胞动作电位和收缩时程延长，对β肾上腺素能刺激反应减弱，引起细胞收缩力降低〔3〕。干预心肌细胞的衰老，对改善心脏器官衰老具有重要的意义。研究发现，男性衰老时睾酮水平明显下降，而睾酮可调节P16INK4a等细胞周期调控因子的表达〔4〕，抑制细胞衰老，但在衰老心肌细胞中未见报道。本研究用不同剂量睾酮干预自然衰老的小鼠心肌细胞，旨在探讨睾酮对心肌细胞衰老的干预作用及其可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂和仪器

　　MEM、胰酶购自Gibco，胎牛血清购自PAA，细胞周期检测试剂盒购自南京凯基生物公司，流式细胞仪购自美国Coulter公司，鼠p16 INK4a单克隆抗体、鼠βactin单克隆抗体购自santa cruz公司，兔cyclinD1多克隆抗体购自博奥森公司，兔RB多克隆抗体购自博士德公司，HRP标记二抗购自santa cruz公司，化学染色试剂盒购自美国Pierce公司。

　　1.2 心肌细胞的培养

　　出生3 d以内的昆明白乳鼠(南方医科大学实验动物中心提供)，酒精消毒后处死，剪取心尖组织，PBS洗3次，剪碎，0.08%胰酶消化数次，每次3 min，消化后收集上清，加入10%胎牛血清培养液，离心后重悬细胞，于5% CO2孵箱中37℃培养1.5 h，将上清加到新瓶培养。同时加入0.1 mol/L BudR抑制成纤维细胞生长。心肌细胞行抗sarcomericactin免疫细胞化学鉴定。

　　1.3 睾酮干预实验

　　心肌细胞随机分为正常对照组(3日龄心肌细胞)、衰老细胞组(28日龄心肌细胞)、1 μmol/L睾酮干预组、100 nmol/L睾酮干预组、10 nmol/L睾酮干预组。均自3日龄起加入相应浓度的睾酮至28日龄止。

　　1.4 机制研究实验

　　为探讨睾酮的作用机制，将心肌细胞随机分为1 μmol/L睾酮+100 μmol/L flutamide组，1 μmol/L睾酮+100 μmol/L ICI182, 780组，100 μmol/L flutamide组。各药物均自3日龄起共同加入至28日龄止。

　　1.5 细胞周期分析

　　0.08%胰酶消化细胞，离心收集细胞，以冰预冷的PBS洗2次，离心，弃上清，缓慢加入70%乙醇，混匀，4℃固定过夜。离心，弃乙醇，冰预冷的PBS洗2次，加入RnaseA(终浓度50 mg/L)溶液，37℃ 30 min，加入碘化丙啶(PI,终浓度50 mg/L)，室温避光反应30 min。上机行流式分析。

　　1.6 RTPCR检测p16INK4a，cyclinD1 mRNA

　　用Trizol提取细胞总RNA，按invitrogen说明书进行，Fermentas逆转录试剂盒制备cDNA。引物序列为p16INK4a：F:5′agctctgctcttgggattgg3′，R:5′gcttcctggacacgctggtg3′，退火温度56℃，目的片段264 bp;cyclinD1：F:5′tcctgctaccgcacaacg3′，R:5′cagaccagcctcttcctcc3′，退火温度54℃，目的片段176 bp;βactin：F:5′acccagatcatgtttgacc3′，R:5′ggtctttacggatgtcaacg3′，退火温度55℃，目的片段520 bp。PCR扩增条件：94℃预变性10 min，94℃变性30 s，退火温度如上30 s，72℃延伸1 min，共36个循环，72℃延伸10 min。取产物5 μl，2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶分析系统扫描并记录靶条带处光密度积分值，计算各目的基因相对表达量。

　　1.7 Western印迹检测p16INK4a，cyclinD1，去磷酸化RB蛋白

　　提取各组心肌细胞总蛋白，测定各组蛋白含量，每孔上样50 μl蛋白，经8%～15%SDSPAGE胶分离后，湿转法将蛋白质转移到PVDF膜上，室温下用5%脱脂牛奶+TBST封闭2 h，分别加入鼠p16INK4a蛋白单克隆抗体(1∶100稀释)，兔cyclinD1蛋白多克隆抗体(1∶100稀释)，兔Rb蛋白多克隆抗体(1∶200稀释)，鼠βactin多克隆抗体(1∶1 000稀释)，过夜孵育，TBST洗15 min×3次，加入HRP标记的羊抗兔或羊抗鼠二抗(1∶2 000稀释)，室温孵育1 h，TBST洗15 min×3次。化学发光法显影于X片上以各目的条带和βactin条带吸光度的比值代表蛋白表达的相对水平。

　　2 结 果

　　2.1 各组细胞周期分布

　　衰老组心肌细胞G0/G1期比例〔(84.47±1.31)%〕较正常对照组〔(72.30±1.12)%〕明显升高(P=0.003)，而睾酮各剂量干预组G0/G1期比例较衰老组均明显降低〔(1 μmol/L组(77.07±2.87)%，P=0.034;100 nmol/L组(78.96±1.25)%，P=0.005;10 nmol/L组(80.80±0.95)%，P=0.001)〕。这一作用具有剂量依赖性(r=-0.654，P=0.02)。

　　2.2 p16INK4a及cyclinD1 mRNA表达

　　衰老组细胞p16INK4a mRNA表达(0.59±0.03)较正常对照组(0.32±0.05)明显升高(P=0.000)，而cyclinD1mRNA衰老组表达(0.29±0.09)较正常对照组(0.64±0.12)明显降低(P=0.000)。1 μmol/L睾酮干预可下调p16INK4a mRNA表达(0.38±0.04)(P=0.000)，上调cyclinD1 mRNA表达(0.05±0.03)(P=0.000)。100 nmol/L和10 nmol/L睾酮干预可降低p16INK4a mRNA表达(0.43±0.05，P<0.001;0.49±0.05，P=0.022)，但对cyclinD1 mRNA表达无明显影响。见图1、图2。机制研究实验发现，单用1 μmol/L睾酮干预组的心肌细胞p16INK4a、cyclinD1 mRNA表达，与1 μmol/L睾酮+100 μmol/L flutamide组相比有显著性差异(P<0.05)，而与1 μmol/L睾酮+100 μmol/L ICI182, 780组相比无显著性差异。单用100 μmol/L flutamide组p16INK4a、cyclinD1 mRNA表达与衰老组相比无显著性差异。见图3、图4。

　　2.3 p16INK4a、cyclinD1及去磷酸化RB蛋白表达

　　与正常对照组p16INK4a蛋白表达(1.77±0.37)和cyclinD1蛋白表达(0.22±0.09)相比，衰老组p16INK4a蛋白表达明显上升(0.24±0.09)(P=0.000)，cyclinD1蛋白表达明显下降(0.87±0.13)(P=0.000)，衰老组去磷酸化RB蛋白表达(9.04±0.96)较正常对照组(2.51±0.51)亦明显增加(P=0.000)。1 μmol/L睾酮干预可上调cyclinD1蛋白表达(0.44±0.13)(P=0.022)，并下调p16INK4a蛋白表达(0.45±0.22)(P=0.000)，减少去磷酸化RB蛋白表达(3.60±0.32)(P=0.000)。100 nmol/L睾酮亦可降低p16INK4a蛋白(1.10±0.18)(P=0.005)及去磷酸化RB蛋白表达(6.08±1.23)(P=0.008), 对cyclinD1无作用。10 nmol/L睾酮可降低p16INK4a表达(1.46±0.09)(P=0.007)，但对cyclinD1及RB表达无影响。见图5。机制研究实验发现，单用1 μmol/L睾酮干预组的心肌细胞p16INK4a、cyclinD1及去磷酸化RB蛋白表达，与1 μmol/L睾酮+100 μmol/L flutamide组相比有显著性差异(P<0.05)，而与1 μmol/L睾酮+100 μmol/L ICI182, 780组相比无显著性差异。单用100 μmol/L flutamide组p16INK4a、cyclinD1及去磷酸化RB蛋白表达与衰老组相比无显著性差异。见图6。

　　3 讨 论

　　本研究发现，未加任何刺激的28日龄小鼠心肌细胞绝大部分稳定的阻滞于细胞的G0/G1期，符合衰老细胞的特征。自然衰老的小鼠心肌细胞p16INK4a mRNA及蛋白表达升高，cyclinD1mRNA及蛋白表达下降，去磷酸化RB蛋白表达上调，这一结果与其他衰老细胞相似〔5〕。cyclinD1为G1期蛋白，在G1/S期交界处发挥作用，与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4/CDK6形成复合体催化RB蛋白磷酸化。而p16INK4a属细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物(CDKI)，p16INK4a可以与cyclinD1竞争结合CDK4/CDK6，阻断CDK4/CDK6途径对RB蛋白的磷酸化。Rb蛋白对G1末期的限制性调控点R点起着闸门的作用，其磷酸化和非磷酸化最终决定细胞周期的进程。在老化的过程中，由于增龄、应激、紫外线等影响，p16INK4a不断积累，但研究发现，p16INK4a的积累不仅是衰老的结果，而且是衰老的诱因。同时，这些影响也使cyclinD1等相关细胞周期蛋白表达下降，这两种变化阻断了CDK4/CDK6激酶对RB蛋白的磷酸化，使其以未磷酸化的活性状态作为生长抑制存在，作用于细胞G1/S调控点，使细胞阻滞于G0/G1期〔5〕。睾酮是体内重要的合成激素，研究发现，正常男性50岁以后，体内睾酮水平随增龄而稳定下降，这一现象提示睾酮水平与衰老进程密切相关，睾酮干预可改善神经衰老，预防脑老化〔6〕。睾酮还可改善血管内皮细胞衰老，预防动脉粥样硬化的发生〔7〕，但对心肌细胞及心脏衰老方面的影响未见报道。研究显示，睾酮可增加乳鼠心肌细胞蛋白合成率〔8〕，并可逆转去势引起的心肌细胞收缩力下降〔9〕。本研究发现，1 μmol/L、100 nmol/L、10 nmol/L睾酮干预均可下调衰老心肌细胞p16INK4a mRNA及蛋白表达，1 μmol/L还可上调cyclinD1mRNA及蛋白表达，使1 μmol/L、100 nmol/L睾酮干预组去磷酸化RB蛋白表达下降。RB蛋白去磷酸化形式减少，与E2FDP1杂二聚体分离，失去了抑制E2F启动DNA合成的作用，从而使细胞由G1期进入S期，细胞G0/G1期比例下降。本研究还发现，10 nmol/L睾酮对RB蛋白的表达没有显著影响，但其仍可以降低细胞G0/G1比例，这可能是由于睾酮还对其他重要的细胞周期调控因子，如P53、P21等产生影响。除此之外，睾酮还能上调SOD，catalase，GSHPx等过氧化物的表达从而降低衰老细胞内ROS水平，减少氧化应激反应，抑制衰老〔10〕。另外，睾酮还可能通过减少线粒体DNA突变率，维持端粒长度、增强端粒酶活性等方面改善心肌细胞的衰老。

　　研究显示，睾酮可通过三种途径发挥细胞内作用，分别是雄激素核受体途径，雄激素膜受体途径以及在芳香化酶的作用下转化为雌激素起作用〔11〕。本研究发现，1μmol/L、100 nmol/L、10 nmol/L睾酮对衰老心肌细胞p16INK4a、cyclinD1、RB表达的调节作用均通过经典的AR核受体途径而发挥的。雌激素受体不能阻断这些作用，而单独应用flutamide不能产生抗衰老作用。

　　总之，睾酮与心肌细胞衰老密切相关，其机制也很复杂，对细胞周期调控因子的调节仅是其中之一，今后还将就其他方面做进一步探讨。明确睾酮对心肌细胞的抗衰老作用及其机制，对防治心脏衰老及预防心力衰竭具有重要意义。

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