腺病毒介导的血管内皮生长因子165对扩张型心肌病大鼠心功能的影响

　　作者：肖俊会1,2， 曾秋棠2， 张宏考1， 王家宁1* 作者单位：(1郧阳医学院附属人民医院心血管内科，湖北 十堰 442000;2华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管病研究所，湖北 武汉 430022)

　　【摘要】 目的:观察经心包腔注射腺病毒介导的血管内皮生长因子165基因(Ad-VEGF 165)对扩张型心肌病(DCM)大鼠心功能的影响并探讨其作用机制。方法：35只雌性SD大鼠腹腔注射多柔比星建立扩张型心肌病模型，随机分为2组：VEGF组(18只)心包腔内注射0.1 mL Ad-VEGF 165 1.0×109 pfu;DCM组(17只)注射生理盐水。比较4周后大鼠左室收缩末期容积(LVES)、舒张末期容积(LVED)、左室收缩末期内径(SD)、左室舒张末期内径(DD)、左室内径缩短率(FS)、左室射血分数(LVEF)和体重(BW)、心率(HR)的变化，观察大鼠心肌组织改变情况，ELISA法测定血清APO-1/Fas含量。结果：VEGF组BW、LVEF、HR、FS较DCM组明显增加(P<0.01);LVES、LVED、SD、 DD均明显降低(P<0.05)，APO-1/Fas水平较DCM组下降(P<0.01);注射VEGF后大鼠BW、LVEF、HR、FS较注射前明显增加(P<0.01);而LVES、LVED、SD、 DD则明显降低(P<0.05)，大鼠的心肌病变减轻。结论：心包注射Ad-VEGF165基因可改善DCM鼠心功能，降低其死亡率，有利于心肌细胞的存活，其机制可能与减少心肌细胞凋亡有关。

　　【关键词】 血管内皮生长因子;扩张型心肌病;超声心动图

　　e-mail:rywjn@vip.163.comEffects of Adenovirus-mediated Vascular Endothelial Growth Factor 165 Gene on Cardiac Function in SD Rats of Dilated Cardiomyopathy Induced by Adriamycin via Pericardial Cavity XIAO Jun-hui1,2,ZENG Qiu-tang2,ZHANG Hong-kao1,WANG Jia-ning1* (1Department of Cardiology,Renmin Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000;2Institute of Cardiology,Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430022,China)

　　Abstract: Objective To study the effects of adenovirus-mediated vascular endothelial growth factor 165 gene on cardiac function in SD rat model of dilated cardiomyopathy(DCM) induced by adriamycin injection via pericardial cavity and explore its possible mechanism.Methods SD rat model of DCM was established at a dose of 2mg/kg once a week by adriamycin intraperitoneally injected and were randomly divided into experimental group and control group.Rats in experimental group received 1.0×109 pfu Ad-VEGF 165 injections via pericardial cavity(VEGF group),while 0.9 % sodium choloride was injected into rats in control group(DCM group).The pericardium was pretreated by injecting a mixture of collagenase(250U)and hyaluronidase(600U).In order to evaluate the effects of Ad-VEGF 165 gene on SD rat models of DCM,transthoracic echocardiography was performed in VEGF group at 4 weeks after treatment with Ad-VEGF 165 gene injection to measure left ventricular dimensions and calculate ejection fraction.At 2 weeks after treatment,left ventricular slices of animal model were processed for histological staining and the concentration of plasma APO-1/Fas was examined with ELISA.Results Compared with the DCM group,the left ventricular ejection fraction(LVEF),body weight(BW) and heart rate(HR) were increased significantly(P<0.01),the left ventricular end diastolic(LVED),diastolic dimension(DD) and systolic dimension(SD) were smaller,the fraction shortening(FS) was larger than that in DCM group(P<0.05),whereas the left ventricular end systolic(LVES) in DCM rats of Ad-VEGF 165 gene injection were decreased markedly(P<0.01)by transthoracic echocardiography measurement.Compared with the DCM group,the LVES and SD in Adriamycin-DCM rats with Ad-VEGF 165 injection were decreased significantly(P<0.01),the LVED and DD were smaller and FS was larger(P<0.05),the LVEF and HR were increased(P<0.01).The levels of plasma APO-1/Fas were lower than that in DCM group.Conclusions Ad-VEGF 165 gene injection via pericardial cavity has therapeutic effect on animal model of dilated cardiomyopathy and is benificial to the survival of myocytes,which may relate to inhibiting myocytes apoptosis and thus offer a novel therpeutic strategy.

　　Key words: Vascular endothelial growth factor;Dilated cardiomyopathy;Ultrasound cardiogram

　　扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy, DCM)是以心肌细胞坏死、间质纤维化、心肌间质胶原重构为主要病理特征，以心腔扩张、收缩功能减退、心律失常、充血型心力衰竭和猝死为临床表现的严重心脏病[1],目前尚缺乏特效的治疗方法和药物。有研究认为凋亡是DCM患者心肌细胞丢失和心功能不全的重要机制,并且其血清sFas和sFas L水平可反映心肌细胞凋亡程度。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)能特异性作用于内皮细胞，促进血管内皮细胞增殖分化和血管生成，改善心肌血供，缩小梗死面积，减少心肌细胞凋亡，抑制促凋亡蛋白的表达，在改善心肌血流动力学方面发挥重要作用。

　　本实验通过多柔比星腹腔内注射建立扩张型心肌病大鼠模型,观察经胶原酶、透明质酸酶预处理心包后心包腔注射腺病毒介导的血管内皮生长因子165(Ad-VEGF 165)对DCM心脏超声心动图改变、心肌组织病理学、及细胞凋亡抑制因子APO-1/Fas浓度的改变，探讨VEGF对DCM的心肌保护作用及可能作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂、仪器、设备

　　Ad-VEGF 165基因(华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管病研究所曾秋棠教授惠赠)、多柔比星(辉瑞制药无锡有限公司)、胶原酶(上海乔源生物制药有限公司)、透明质酸酶(上海君创生物有限公司);动物呼吸机(美国Matrix公司)、心电监护仪GE 2000(美国GE公司)、GE-VIVID7型彩色多普勒(超声探头频率11MHz，美国GE公司)。人Fas ELISA试剂盒(深圳晶美生物工程公司提供，美国Genzyme公司产品分装 )、Bio-Rad 酶标仪(美国Genzyme公司)。

　　1.2 扩张型心肌病大鼠模型建立

　　出生4周的雌型SD大鼠40只，屏障系统环境下，专用饲料和无菌水喂养。多柔比星用生理盐水配成1 mg/mL，每周2 mg/kg腹腔内注射,连续8周。用药前及第9周时用10%水合氯醛0.35 mL/100 g麻醉后,胸骨旁左心室长轴超声心动图测量左室收缩末期容积(LVES)、舒张末期容积(LVED)、左室收缩末期内径(SD)、左室舒张末期内径(DD)、左室内径缩短率(FS)、左室射血分数(LVEF)。剪开左心室取心肌组织,10%甲醛固定，石蜡包埋,HE染色、苦味酸-酸性品红复染(V-G), 镜下观察心肌组织改变及心肌间胶原纤维变化。

　　经超声心动图检测LVEF、HR明显降低，心室的收缩功能与心腔的扩张程度负相关，所有改变符合扩张型心肌病的影像学特征，扩张型心肌病(DCM)大鼠模型复制成功。实验过程中先后有5只动物死亡，其余35只大鼠随机分成实验组(VEGF组，18只)和对照组(DCM组，17只)，平均体重(142.9±56.1) g。

　　1.3 实验方法

　　VEGF组大鼠10%水合氯醛麻醉、气管插管、呼气机支持、心电监护，于左胸第4肋间打开胸腔，充分暴露心脏并分离心包，以含胶原酶250 U及透明质酸酶600 U的生理盐水0.1 mL预处理心包后，在心包腔内注射0.1 mL Ad-VEGF 165 1.0×109 pfu;DCM组同样方法预处理心包，但只在心包腔内注射生理盐水0.1 mL。术后第1周每日青霉素(10万U/kg)皮下注射。大鼠在注射VEGF前及第4周时麻醉后, 胸骨旁左心室长轴测量LVES、LVED、SD、DD、FS、LVEF。

　　1.4 APO-1/Fas测定

　　采球后静脉血 2 mL，离心3 min取血清，编号后于-20 ℃低温冰箱保存至同批测定。采用ELISA法从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条，分别将不同浓度标准品或标本(100 μL/孔 )加入相应孔中用封板胶纸封住反应孔，20～25 ℃孵育1 h。洗涤液洗4次拍干，加入100 μL检测液，封住板孔20～25 ℃孵育30 min，洗涤拍干4次，加入100 μL 终止液避光静置20 min。Bio-Rad 酶标仪450 nm测吸光度，绘制标准曲线求出标本中APO-1/Fas浓度 (μg/L)，表示心肌凋亡抑制程度。同样方法取左心室心肌组织,观察心肌组织改变及心肌间胶原纤维变化情况。

　　1.5 统计分析

　　数据采用SPSS 11.0软件分析,结果以均值±标准差(x±s )表示,t检验比较组间差异,P<0.05表示有显著性差异，P<0.01表示有极显著性差异。

　　2 结果

　　2.1 一般情况

　　DCM组大鼠时有少动、疲倦无力等表现，陆续有动物出现拒食水、体重下降、抽搐，先后6只动物死亡，死亡率35.29%;VEGF组大鼠以上症状较轻，部分动物少动，4只动物死亡，死亡率为22.22% 。

　　2.2 两组动物超声心动图变化

　　VEGF组BW、LVEF、HR、FS较DCM组明显增加(P<0.01);LVES、LVED、SD、 DD均明显降低(P<0.05)，APO-1/Fas水平较DCM组下降(P<0.01)，有1只动物出现少量心包积液，而DCM组有3只动物出现少量心包积液，2只出现大量心包积液(见表1)。

　　大鼠注射VEGF后，BW、LVEF、HR、FS较注射前明显增加(P<0.01);而LVES、LVED、SD、 DD则明显降低(P<0.05)(见表2)。表1 VEGF组与DCM组超声心动图检测及血浆　APO-1/Fas浓度变化表2 注射VEGF前、后大鼠超声心动图比较：与VEGF前比较，*P<0.05;**P<0.01

　　2.3 心肌组织的病理改变

　　DCM组大鼠心肌细胞有不同程度的颗粒变性和空泡样变性，胞质自溶，组织间质水肿，细胞间隙增宽，心肌细胞数目明显减少，心肌胶原纤维增生明显;VEGF组大鼠心肌病变较DCM组明显减轻，可见颗粒变性和空泡样变性，心肌间胶原沉积少于DCM组,可见新生血管样结构。

　　3 讨论

　　多柔比星属于周期非特异性药物，除对各期肿瘤有杀伤作用外，对正常组织细胞也有杀伤作用，尤以心脏毒性最重。多柔比星在机体内易产生自由基和细胞损伤氧化反应,从而导致心肌结构的各种改变[2]。Delpy等[3]提出多柔比星通过神经酰胺诱导细胞凋亡;Kit ta等[4]发现多柔比星能够促进bcl-2表达下调;Liu等[5]发现多柔比星导致大鼠心肌细胞中p53蛋白增加。黄荣杰[7]等采用呋喃唑酮喂养Wistar大鼠建立DCM模型，诱导出DCM的成功率为66.6%。本实验给予多柔比星每周2 mg/kg腹腔内注射连续8周，超声心动图检测显示LVES、SD明显增加，LVED、DD、FS较实验前有显著性改变，LVEF、HR明显降低，显示心室的收缩功能与心腔的扩张程度负相关;且心肌组织病理学的改变符合DCM病理学特征，诱导成功率81.25%，提示此剂量及给药方法可成功制作扩张型心肌病大鼠模型。

　　Narula等[8]发现DCM患者心肌细胞凋亡发生率为5.5 ～35.5%，凋亡导致的心肌细胞减少可能是心功能进行性恶化的重要机制之一。近年来有研究表明,心肌细胞凋亡在晚期DCM明显增多[9-10]。扩张型心肌病阶段，心肌细胞大量丢失，心肌纤维化是主要病理特征，由于此时致细胞坏死的因素消失，心肌细胞以及心肌间质细胞的凋亡就成为心肌纤维化的主要原因[11]。心肌纤维化时胶原组织紧密包绕正常心肌，致使心肌细胞慢性缺氧，最终可导致心肌细胞凋亡，形成恶性循环[12]。血清可溶性APO-1/Fas分子是由于 RNA剪切方法不同造成跨膜区缺血所致,由于缺乏跨膜蛋白而游离于血清中Fas分子称可溶性APO-1/Fas,Fas基因转录的mRNA变换剪接时丢失363个碱基对框架,造成跨膜区缺失使之不能与膜结合,而释放入血清。APO-1/Fas与Fas 竞争结合Fas配体(Fas L),同时,APO-1/Fas不具生物活性,Fas L提供的信号在到达细胞内之前被阻断,导致对凋亡的抑制[13]。

　　VEGF作为一种特异性血管因子，在诱导血管生长过程中发挥了关键性作用，同时它也具有直接的心脏保护效应。急性心肌梗死、心绞痛、扩张性心肌病等多种疾病无不与VEGF的变化息息相关。Terplex DNA介导转载VEGF使动物梗死心肌周围血管密度增加50%，心室舒张压、心室收缩区和舒张区面积明显增加，改善左室功能，缩小梗死面积[14]。PDGF、VEGF、Ang-2的协同作用使高龄衰老的动物心功能得到瞬时保护，使心肌梗死率下降50%[15]。新近的一项研究表明，在DCM动物模型中，直接Ad-VEGF 165注射与经Ad-VEGF 165转染骨成肌细胞(SKMB)，经超声心动图和组织学评价，均有助于提高左室功能,原因不一定是VEGF的高表达，而是进一步减少了心肌细胞的凋亡[16]。但最理想的输送VEGF，改善心功能的方法目前仍不明确。

　　经心包腔转染靶基因进行基因治疗是一种新尝试，但是心包壁层对转染基因可能有屏障作用。为提高靶基因的渗透效率，Lazarous[17]、Fromes等[18]发现用胶原酶及透明质酸酶预处理成年雄性 Wistar大鼠心包后，可持续表达VEGF 165基因 。本实验经胶原酶、透明质酸酶预处理心包后，心包腔注射Ad-VEGF 165基因作用于DCM大鼠，超声心动图显示LVEF、HR均明显增加，LVES明显降低，LVED、DD、SD较实验前有显著性差异，VEGF组死亡明显低于DCM组，提示此剂量及给药方法可明显改善DCM鼠心功能，使左室收缩末期容积明显降低，APO-1/Fas水平下降，心肌细胞凋亡受抑制，从而可以改善心功能、减轻DCM鼠心肌病理改变，降低死亡率。

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