新疆蒙古族冠心病患者内皮型一氧化氮合酶基因G894T多态性

　　作者：冯秀丽 杨忠伟 江雪萍 肖 白1 作者单位：(新疆生产建设兵团农七师医院，新疆 奎屯 833200)

　　【摘要】 目的 探讨新疆蒙古族人群内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因多态性与冠心病的相关性。方法 应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析(PCRRFLP)，检测新疆蒙古族82例正常个体和86例冠心病患者eNOS基因G894T多态性。结果 新疆蒙古族正常个体及冠心病患者的eNOS基因G894T多态性GG、GT、TT基因型频率分布分别为0.80、0.16、0.04和0.81、0.07、0.12，G和T等位基因分布频率分别为0.88、0.12和0.85、0.15，冠心病患者有GT基因型频率下降，TT基因型频率升高趋势，但差异不显著(χ2=3.637 9,P>0.05)。结论 eNOS基因G894T多态性可能与新疆蒙古族冠心病有关，但有待进一步研究。

　　【关键词】 冠心病;蒙古族;内皮型一氧化氮合酶基因;基因多态性

　　冠心病是由遗传和环境因素共同作用所致的复杂疾病,发病过程与多基因之间、基因环境之间的相互作用等有关。目前有学者认为，可能存在多个与冠心病相关的基因,这些基因单个起作用或联合作用,还可能与传统易感因素共同作用而增加冠心病的危险性。我们应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析(PCRRFLP)检测了新疆82例蒙古族正常个体和86例冠心病患者内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因G894T突变的情况。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 随机抽取168例新疆地区无血缘关系的蒙古族正常人群和蒙古族冠心病患者的静脉血各3 ml，EDTAK2抗凝，充分混匀后放入20℃冰箱冷藏室保存待检。蒙古族正常人群经检查已排除冠心病、高血压、糖尿病及脑血管病，共82例，其中男性45例，女性37例，年龄32～74岁;蒙古族冠心病人86例，其中男性33例，女性53例，年龄35～87岁。蒙古族冠心病人均符合1979年WHO冠心病诊断标准且心电图检查均为陈旧性心肌梗死患者。

　　1.2 主要仪器 Master cycler R eppendorf PCR仪购自上海艾本德生物技术国际贸易有限公司;琼脂糖、溴化乙锭(EB)购自上海生物工程有限公司。UVP AC暗箱+凝胶成像仪，购自天美有限公司。

　　1.3 DNA的提取 常规酚抽提法提取基因组DNA。BioRad紫外分光光度计测定DNA浓度并标化至100 ng/μl。

　　1.4 PCR检测eNOS基因G894T多态性 ①引物设计与合成：参照文献〔1〕设计引物：上游引物5′AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA3′;下游引物：5′CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA3′， 扩增后的PCR产物为248 bp。②PCR扩增：反应体系为25 μl，包括DNA模板1.0 μl、 10倍Buffer (Mg2+) 2.5 μl，dNTP Mix 2.0 μl，上游引物0.2 μl，下游引物0.2 μl Taq 酶Merase 0.2 μl，灭菌双蒸水 18.9 μl。③PCR仪扩增反应条件：预变性为95℃ 2 min，变性95℃ 30 s，退火66℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共37个循环，最后72℃延伸5 min。经2.5%琼脂糖凝胶电泳，100 V，30 min，EB染色后置凝胶成像仪上观察特异性条带，打印并记录了实验结果。④基因型检测：限制性酶切反应体系10 μl，包括 PCR产物8.4 μl、10倍Buffer 1 μl、BanⅡ内切酶(大连宝生物提供)0.6 μl，37℃酶切2 h终止。酶切产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪成像，观察基因型。

　　1.5 统计学分析 计算新疆蒙古族正常人群和冠心病患者两组基因型频率和等位基因频率，经过Hardy Weinberg遗传平衡定律检验，表明各基因型频率已达遗传平衡，具有群体代表性。各组间频率比较用χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 电泳结果 G等位基因存在BanⅡ酶切位点，而T等位基因没有BanⅡ酶切位点，因此GG基因型酶切产物为163和85 bp，GT基因型具有248和163 bp，TT基因型酶切产物为248 bp，结果见图1、图2。

　　2.2 新疆蒙古族正常人群eNOS基因频率 在82例样品中，GG型66例，GT型 13例，TT型3例，三种基因型的频率分别为0.80、0.16、0.04，G和T等位基因分布频率分别为0.88、0.12。经χ2检验，这些比例与Hardy Weinberg平衡相一致(χ2=0.185 8，P>0.05)，具有群体代表性。等位基因频率男女间分布无显著性差异(χ2=0.021 9，P>0.05)，见表1。表1 新疆蒙古族正常人群eNOS基因型及等位基因频率分布

　　2.3 新疆蒙古族冠心病患者eNOS基因频率 在86例样品中，GG型70例，GT型6例，TT型10例，三种基因型的频率分别为0.81、0.07、0.12，G和T等位基因的频率分别为0.85、0.15。经χ2检验，这些比例与Hardy Weinberg平衡相一致(χ2=0.423 5，P>0.05)，具有群体代表性。等位基因频率男女间分布无显著性差异(χ2=0.091 4，P>0.05)，见表2。

　　2.4 新疆蒙古族正常人群与冠心病患者eNOS基因 G894T多态性GG、 GT、 TT以及G和T等位基因分布频率比较，新疆蒙古族冠心病患者eNOS基因G894T多态性有GT基因型频率下降，TT基因型频率升高趋势，但与蒙古族正常人相比差异不显著，而G和T等位基因频率分布无显著差异，见表3。表2 新疆蒙古族冠心病患者eNOS基因型及等位基因频率分布表3 新疆蒙古族正常人群及冠心病患者eNOS基因G894T多态性分布比较　M为Marker标记物;1’、 2’、3’、6’、7’为GG基因型;4’、8’为GT基因型;1～8，5’为TT基因型图1 蒙古族正常人群PCR产物及经BanⅡ酶切后琼脂糖凝胶电泳M为Marker标记物;1’、 2’、3’为GG基因型;5’为GT基因型;1～5，4’为TT基因型图2 蒙古族冠心病患者PCR产物及经BanⅡ酶切后琼脂糖凝胶电泳

　　3 讨 论

　　eNOS是左旋精氨酸一氧化氮(NO)途径的关键酶，eNOS催化生成的NO具有舒张血管、调节血流、抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移和清除超氧自由基、抑制血小板聚集、黏附和白细胞的趋化激活等重要功能，是心血管系统抗动脉粥样硬化、防止血栓形成和维持正常血管舒缩反应中必不可少的保护因子〔2〕。有研究发现，eNOS基因第7外显子中的G894T突变和冠心病的发病及心肌梗死的风险有关〔3，4〕。Colambo等〔5〕的研究显示G894T错义突变与意大利人冠心病的存在和严重程度相关。eNOS基因分布不同，存在种族差异〔6〕。本研究发现新疆蒙古族冠心病人中存在eNOS基因G894T多态性GT基因型频率下降，TT基因型频率升高趋势，但与蒙古族正常人差异不显著，可能与年龄差异以及样本量小有关，目前还不能完全排除新疆蒙古族冠心病的发生与eNOS基因 G894T突变的相关性，有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　1 Adam V，Benjafield D，Brain J,et al.Association analysis of endothelial nitric oxide synthase gene in essential hypertension〔J〕.Am J Hyper,2000;13(9):9948.

　　2 Lefer AM.Nitric oxide nature′s naturally occurring leukocyte inhibitor〔J〕. Circulation，1997;95(3):5534.

　　3 Lee WH，Hwang TH，Oh GT,et al.Genetic factors associated with endothelial dysfunction affect the early onset of coronary artery disease in Korean males〔J〕.Vasc Med，2001;6(2):1038.

　　4 唐欧杉,徐 耕，秦丰明，等.内皮型一氧化氮合酶基因多态性和早发冠心病的相关性研究〔J〕.岭南心血管病杂志，2004;10(4):2936.

　　5 Colambo MG，Andreassi MG，Paradossi U,et al.Evidence for association of a common variant of the endothelial nitric oxide synthase gene (Glu298 Asp polymorphism) to the presence extent and severity of coronary artery disease〔J〕.Heart，2002;87(6):5258.

　　6 Miyamoto Y，Saito Y，Kajiyama N,et al.Endothelial nitric oxide synthase gene is positively associated with essential hypertension〔J〕. Hypertension,1998;32(1):38.