ＡＴＰ敏感钾通道在硫化氢钠对抗β-淀粉样肽诱导细胞损伤中的作用

　　作者：廖新学， 唐小卿， 郭瑞鲜， 杨春涛， 刘微， 陈培熹， 冯鉴强 作者单位：中山大学 附属第一医院心血管内科，高血压血管科

　　【摘要】 【目的】 探讨ATP敏感性钾通道 (KATP) 在硫化氢(H2S) 对抗β-淀粉样多肽 (Aβ) 诱导嗜铬细胞瘤细胞(PC12)细胞损伤中的作用。【方法】 应用硫化氢钠 (NaHS) 作为H2S 的供体，碘化丙啶 (PI) 染色流式细胞技术 (FCM) 检测细胞凋亡率，Hoechst染色检测细胞凋亡的形态学变化， 罗丹明123 (Rh123) 染色FCM检测细胞线粒体膜电位 (MMP)，双氢罗丹明123 染色FCM检测细胞内活性氧 (ROS) 的含量。【结果】 20 μmol/L和40 μmol/L Aβ25-35能明显地诱导PC12细胞凋亡，增加细胞凋亡率，并能明显地抑制PC12细胞MMP及增加细胞内ROS生成;100 mol/L和200 μmol/L NaHS本身不损伤PC12细胞，但能明显地抑制Aβ25-35的致细胞凋亡作用，降低PC12细胞的凋亡率，并能显著地抑制Aβ25-35引起的MMP降低及胞内ROS水平增多;在应用NaHS与Aβ25-35作用PC12细胞之前30 min，应用KATP抑制剂Glybenclamide (Gly) (10 μmol/L) 对PC12细胞进行预处理，能部分地对抗NaHS的细胞保护作用，使PC12细胞凋亡率增加，MMP降低及ROS生成增多。【结论】 NaHS能明显对抗Aβ25-35对PC12细胞的损伤作用，此细胞保护作用可能与NaHS保护PC12细胞的MMP及抑制胞内ROS生成有关;KATP通道抑制剂Gly能部分地阻断NaHS的细胞保护作用，提示KATP通道开放可能是NaHS对抗Aβ25-35损伤作用的机制之一。

　　【关键词】 硫化氢;β-淀粉样多肽;线粒体膜电位;活性氧;ATP敏感性钾通道

　　Role of ATP-Sensitive K+ Channels in Protection of NaHS against β-amyloid Peptide-Induced Damage in PC12 Cells

　　LIAO Xin-xue， TANG Xiao-qing， GUO Rui-xian， YANG Chun-tao， LIU Wei， CHEN Pei-xi， FENG Jian-qiang

　　(Department of Cardiovasology and Department of Hypertension and Vascular Diseases， The First Affiliated Hospital， Guangzhou 510080， China; Department of Physiology， Zhongshan Medical College， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510080， China; Department of Physiology， Nanhua University， Hengyang 421001， China)

　　Abstract： 【Objective】 To explore the role of ATP-sensitive K+ channels in the protection of hydrogen sulfide (H2S) against β-amyloid-induced injury in PC12 cells. 【Methods】 Sodium hydrosulfide (NaHS) was used as a H2S donor. The percentage of apoptotic cells was assessed by propidium iodide stain flow cytometry(FCM). The morphological change of apoptotic cells was tested by using the chromatin dye Hoechst 33258. The mitochondrial membrane potential (MMP) was analyzed by rhodamine 123 stain FCM. The level of reactive oxygen species (ROS) in PC12 cells was measured by dihydrohodamine 123 stain FCM. 【Results】 Amyloid β-peptide 25～35 (Aβ25-35) at 20 μmol/L and 40 μmol/L significantly induces PC12 cells apoptosis; and inhibits MMP and induces ROS in PC12 cells. NaHS at 100 μmol/L or 200 μmol/L alone did not damage PC12 cells，but obviously attenuated Aβ25-35 induced apoptosis，and blocked the dissipation of MMP and the over-production of ROS induced by Aβ25-35;The ATP-sensitive K+ channel (KATP) inhibitor， glybenclamide(Gly)，which was pretreated 30 min before co-administration of NaHS and Aβ25-35， obviously and partly blocked the cytoprotection of NaHS， increasing the percentage of apoptosis; Furthermore， Gly at 10 μmol/L partly and significantly blocked the preservation of MMP and inhibition of overproduction of ROS afforded by NaHS. 【Conclusion】 NaHS obviously protected PC12 cells against the damage induced by Aβ25-35， the cytoprotection of NaHS was associated with the preservation of MMP and inhibition of ROS over-production; KATP channel inhibitor， Gly， significantly partly blocked the cytoprotection of NaHS， indicating that KATP channels activation played an important role in the protection of NaHS against PC12 cells damage induced by Aβ25-35.

　　Key words： hydrogen sulfide; β-amyloid peptide; mitochondrial membrane potential; reactive oxygen species; ATP-sensitive K+ channels

　　近年，内源性气体信号分子如一氧化氮(nitric oxide， NO)[1]和一氧化碳(carbon monoxide，CO)[2]在体内病理生理过程中的重要作用日益受到重视;目前，越来越多的证据支持内源性硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)是体内第3种气体信号分子[3]， 其具有多种的生理作用， 例如调节突触活动，影响海马长时程增强(long term potentiation， LTP)[4]及舒张血管[5]等。有研究指出，脑内H2S的浓度可达到50 ～ 160 μmol/L[4]。阿尔茨海默病(Alzheimer?蒺s disease，AD)患者脑内的H2S水平约降低55%[6]，提示H2S可能涉及AD的发生发展过程。

　　现已证实，AD患者脑内存在老年斑块(senile plagues)，其主要成分是β-淀粉样肽(amyloid β-peptide，Aβ)。Aβ通过诱发氧化应激和神经细胞凋亡(apoptosis)在AD的发病机制中起着重要的作用[7，8]。 最近，我们观察到，硫化氢钠(sodium hydrosul-fide， NaHS， H2S的供体)能对抗Aβ诱导大鼠嗜铬细胞瘤细胞株PC12(pheochromocytoma cells， PC12细胞)凋亡[9]，但其机制尚未明了。H2S被认为是内源性ATP敏感性钾通道的开放剂(ATP-sensitive K+ channels opener)，因此，本文旨在探讨ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive K+ channels， KATP)在H2S对抗Aβ-诱导PC12细胞损伤中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂

　　碘化丙啶(PI)、Rnase A、甲氮甲唑蓝(MTT)、罗丹明123(Rh1233)、双氢罗丹明(DHR)、Aβ25～35，ATP敏感性钾通道抑制剂Glybenclamide与NaHS购自Sigma公司;RPMI-1640培养基、马血清、胎牛血清购自Gibico BRL公司(NY USA)。

　　1.2 细胞培养和实验分组

　　PC12细胞由中山大学实验动物中心提供，培养于含100 mL/L马血清、50 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养基中。于37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养，选取对数生长期细胞进行实验。

　　实验分为①空白对照组;②不同浓度Aβ25-35损伤组：分别应用20 μmol/L 和40 μmol/L Aβ25-35作用PC12细胞24 h;③不同浓度NaHS单纯作用组：分别应用100 μmol/L和200 μmol/L NaHS孵育PC12细胞24 h;④NaHS+Aβ25-35共同作用组：分别应用不同浓度(100 μmol/L与200 μmol/L)NaHS与不同浓度(20 μmol/L与40 μmol/L)Aβ25-35共同作用PC12细胞24 h;⑤ATP敏感性钾通道抑制剂+NaHS+Aβ25-35作用组。

　　1.3 PI染色流式细胞仪(FCM)检测PC12细胞凋亡

　　收集多组细胞，用PBS洗2遍，用700 mL/L 乙醇4 ℃固定过夜，取106已固定的细胞，用PBS洗两遍，去上清后加入300 μL DNA染液(内含PI 100 μg/mL和Rnase A 20 单位/mL)，于4 ℃冰箱中放置45 min，300目尼龙网过滤，上流式细胞仪(美国BENKMAN-COULTER公司出品)检测(激发波长：488 nm;发射波长：610 nm)细胞DNA的含量。以DNA组方图中低于G1期DNA含量的亚G1峰的大小代表凋亡细胞数的多少。

　　1.4 Hoechst染色检测细胞凋亡

　　把PC12 细胞接种于24孔板内，按实验分组要求给以下不同的处理因素作用一定时间，加入新鲜配制的40 g/L多聚甲醛，4 ℃固定细胞10 min，加入5 mg/L Hoechst 33258 染色液作用10 min，PBS冲洗，荧光显微镜下观察、摄片。正常细胞核呈弥漫均匀的低强度荧光，细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光，记为凋亡细胞。

　　1.5 细胞线粒体膜电位的检测

　　Rh123是一种为线粒体所吸收的荧光染色，其吸收值随线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)的改变而呈相应的变化，从而改变细胞的荧光强度。因此，可通过检测细胞RH123的荧光强度反映细胞的MMP。药物处理24 h后， 用0.25 g/L 胰蛋白酶消化贴壁的PC12细胞， 收集1 × 106细胞，用PBS 洗两次。取储存于-20℃溶于DMSO的1 g/L Rh123，用不含小牛血清的RPMI-1640 稀释至100 μg/L，重悬上述细胞，避光于37℃孵育45 min 后进行流式细胞仪测定(激发波长488 nm，发射波长525 nm)，测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理。计数10 000 个活细胞， 以阳性细胞的平均荧光强度(MFI)表示MMP。

　　1.6 细胞内ROS 含量的检测

　　按前文[9]介绍的方法测定细胞ROS的含量，即用双氢罗丹明处理PC12细胞12 h后倾去陈旧培养基， 用无血清的RPMI-1640洗2次， 加入用无血清的RPMI-1640稀释的终浓度为1 μmol/L的双氢罗丹明， 避光于37℃孵育1 h 后， 收集细胞，PBS洗1次， 制成1 × 108/L 的悬液，上流式细胞仪检测(激发波长488 nm，发射波长525 nm)，测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理。每个样品测定10 000个活细胞， 直方图分析Rh123的平均荧光强度(MFI)，该值即代表细胞ROS的水平。

　　1.7 统计分析

　　全部数据经SPSS 10.0统计软件进行统计分析，数据用均数±标准差(x±s)表示，组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验，有统计学意义后用最小有意义差异检验(least significant difference， LSD)进行均数间的多重比较，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 NaHS抑制Aβ25-35诱导的细胞凋亡

　　Hoechst 33258染色检测细胞凋亡的结果显示， 20 μmol/L Aβ25-35 处理PC12 细胞24 h 后， PC12细胞呈现明显的凋亡特征， 如细胞核浓缩等(图1C)。100 μmol/L NaHS自身不引起PC12细胞凋亡(图1B)， 但其与20 μmol/L Aβ25-35共同处理PC12细胞24 h，能使Aβ25-35引起的具有凋亡特征的细胞数目明显减少(图1D)。FCM检测的实验结果统计分析也显示， 100 μmol/L和200 μmol/L NaHS均能显著地降低20 μmol/L 和40 μmol/L Aβ25-35引起的PC12 细胞凋亡率(P < 0.01，图1) 。

　　2.2 KATP通道抑制剂拮抗NaHS引起的抗细胞凋亡作用

　　H2S被认为是KATP通道的开放剂(Opener)，为了探讨KATP通道开放是否与NaHS对抗Aβ25-35引起PC12细胞凋亡的作用有关。本文在应用100 μmol/L NaHS与20 μmol/L Aβ25-35作用PC12 细胞之前30 min，应用10 μmol/L KATP通道的抑制剂Glybenclamide (Gly) 对PC12细胞进行预处理 (pretreatment)。图2的结果显示，10 μmol/L Gly自身不影响PC12细胞的凋亡率，但是却能显著地部分地拮抗100 μmol/L NaHS对抗20 μmol/L Aβ25-35的致凋亡作用 (P < 0.01)，提示NaHS的细胞保护作用可能与其开放KATP通道有关。

　　2.3 KATP通道抑制剂拮抗NaHS抑制Aβ25-35降低MMP的作用

　　MMP降低是细胞凋亡早期的一个重要特征。Rh123荧光染色法可检测荧光强度的大小反映MMP的改变。图3显示，PC12细胞经20 μmol/L Aβ25-35作用6 h后，MMP明显降低(图3D)，100 μmol/L NaHS本身不影响Rh123荧光强度(图3B)，但当其与20 μmol/L Aβ25-35共同作用PC12细胞6 h后，NaHS能显著地抑制20 μmol/L Aβ25-35引起的MMP降低(图3E)。图3G为FCM的平均荧光检测强度(MFI)的统计结果，同样显示NaHS能明显地抑制Aβ25-35引起PC12细胞MMP降低。

　　为了探讨KATP通道开放是否参与H2S的保护MMP作用，本文观察KATP通道抑制剂Gly (10 μmol/L) 预处理(预处理方法与上述的方法相同)对H2S抑制Aβ25-35降低MMP作用的影响。图3C与G的结果表明，10 μmol/L Gly本身对PC12细胞的MMP无明显影响，但是能明显地部分地阻断NaHS抑制MMP降低的作用(图3F和G，P < 0.01)，提示NaHS抑制Aβ25-35降低MMP作用的机制之一可能与其开放KATP通道有关。

　　2.4 KATP通道抑制剂对NaHS抑制ROS生成增多的影响

　　图4显示PC12细胞被20 μmol/L Aβ25-35处理3 h后，其胞内的双氢罗丹明荧光强度明显增多(图4D与正常对照组图4A比较)，提示Aβ25-35引起胞内ROS生成增多。然而当自身不影响ROS生成(图4B)的100 μmol/L NaHS与20 μmol/L Aβ25-35共同作用于PC12细胞3 h后， 胞内的双氢罗丹明荧光强度显著减小(图4E)，提示NaHS能抑制Aβ25-35引起的PC12细胞ROS生成增多。值得注意的是，KATP通道抑制剂Gly(10 μmol/L) 预处理能明显地拮抗NaHS抑制ROS生成作用(图4F)，提示KATP通道开放可能在H2S抑制胞内ROS生成中起着一定的作用。10 μmol/L Gly本身不影响ROS水平(图4C)。

　　3 讨论

　　老年性痴呆(AD)是一种神经性退行性疾患，其病理特征是脑内呈现老年斑(senile plagues)。Aβ是细胞外老年斑的主要成分。Aβ来源于淀粉样前体蛋白 (amyloid precursor protein，APP) 的蛋白水解物，具有39 ～ 43个氨基酸，其中25 ～ 35片断被认为具有神经毒性，很可能是AD病理机制的关键[10]。

　　为了探讨H2S能否对抗Aβ引起神经元损伤及其作用机制，本文在具有神经元的形态及功能特征的PC12细胞建立Aβ25-35致细胞损伤模型，应用NaHS作为H2S的供体，观察不同浓度NaHS对Aβ25-35损伤PC12细胞作用的影响。本文的研究结果表明，20 μmol/L～40 μmol/L Aβ25-35能明显引起PC12细胞凋亡(图1)，并引起MMP降低及胞内ROS明显增多。Wang等人也观察到Aβ25-35诱导氧化应激 (oxidative stress)并引起PC12细胞凋亡[11]。

　　另有研究指出，Aβ能直接地与线粒体基质 (mitochondrialmatrix)内的Aβ结合乙醇脱氢酶 (Aβ-bindingalcohol dehydrogenase，AβAD) 相互作用，从而导致ROS生成增多、线粒体丧失功能及细胞凋亡[12]。这些研究支持本文的上述实验结果。

　　重要的是本文在证实了H2S能对抗Aβ25-35引起的细胞凋亡、MMP降低及ROS升高等损伤作用的基础上，进一步探讨了KATP通道在NaHS抗氧化应激的细胞保护机制中的作用。

　　H2S是一种作用较强的内源性ATP敏感的钾通道开放剂 (ATP-sensitive K+ channel opener)[13]。KATP通道开放能保护心肌细胞对抗氧化应激引起的凋亡[14]。本文观察到KATP通道抑制剂Glybenclamide (Gly)能明显地部分地阻断H2S抑制Aβ25-35的细胞损伤作用，使凋亡率显著增加，并能部分地拮抗H2S保护MMP及抑制ROS生成作用，提示KATP通道开放可能是H2S对抗Aβ25-35细胞损伤作用的重要机制之一，值得今后进一步探讨。

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