伊布利特对兔心房肌细胞快钠电流活性的影响
发表时间：2010-07-26 浏览次数：409次
作者：姚浩洁 何振山 齐书英 刘晓云 王洁 作者单位：廊坊市人民医院心内科，白求恩国际和平医院心内科 河北 廊坊 065000
【摘要】 目的 探讨伊布利特对兔心房肌细胞快钠通道电流(INa)的影响。方法 30只兔随机分为正常对照组(Con，10只)，伊布利特10-6mol/L浓度组(10-6，10只)，伊布利特10-5mol/L浓度组(10-5，10只)。用膜片钳技术研究伊布利特对兔心房肌细胞INa的改变。结果 10-6与10-5组INa峰值电流密度均降低且呈浓度依赖型;10-6与10-5组的INa电压依赖性稳态失活曲线与正常对照组相比，失活曲线明显左移，以10-5左移最明显。10-6与10-5组INa再恢复明显减慢，再恢复时程延长，与对照组比较有显著性差异;10-6与10-5组之间比较有明显差异(P<0.05)。结论 伊布利特干预后心房细胞INa电流活性降低，INa电流-电压曲线(I-V曲线)上移，INa电压依赖性稳态失活曲线左移，INa失活后再恢复时间延长。
【关键词】 伊布利特;兔;心房肌细胞;膜片钳 ;快钠通道
近年来研究表明，新型Ⅲ类抗心律失常药物伊布利特(ibutilide)在多数临床试验中证明有快速转复房颤、房扑的作用，成为治疗心律失常的主要药物之一〔1〕。目前国内外已对伊布利特的电生理作用做了大量研究〔2，3〕，证实伊布利特通过抑制复极时K+外向电流(Ikr)，促进平台期缓慢内向Na+电流和内向Ca2+电流，从而延长动作电位(APD)时程和有效不应期(ERP)，降低局部心肌的传导时间〔4〕，终止折返激动。国内外对伊布利特离子通道的研究主要集中在各种K+电流、Ca2+电流及缓慢内向Na+电流，而对快钠离子通道的研究未见相关报道。本研究以酶解法分离新西兰大白兔心房细胞，采用全细胞膜片钳记录技术直接记录不同浓度伊布利特对心房细胞快钠通道(INa)的影响，从而探讨其抗房颤/房扑的部分离子通道机制，从而对临床中伊布利特的应用起指导作用。
1 材料与方法
1.1 动物
新西兰纯种大耳白兔30只(由华北制药厂实验动物中心提供),雌雄不拘,18～20周龄，体重1.5～2.0 kg,随机分为正常对照组(Con，10只)，伊布利特10-6mol/L浓度组(10-6，10只)，伊布利特10-5mol/L浓度组(10-5，10只)。
1.2 试剂与药品
①无钙台氏液(mmol/L)：NaCl 140，NaHCO3 11.9，KCl 5.4，MgCl2 0.53，NaHPO4 0.33，HEPES 5，葡萄糖10,用NaOH调节pH至7.3;②含酶液：无钙台氏液中加入0.4 g/L胶原酶I和0.7 g/L牛血清白蛋白;③KB液(mmol/L):KOH 70，KCl 40，KH2PO4 20，L-谷氨酸50，牛磺酸20，EGTA 0.5，HEPES 10，葡萄糖10,用KOH调节pH至7.3;④INa电极内液(mmol/L):CsCl 130，MgCl2 2，NaCl 10，HEPES 10,用CsOH调节pH至7.3;⑤INa电极外液(mmol/L):氯化胆碱100，NaCl 50，MgCl2 2，HEPES10,葡萄糖10,用NaOH调节pH至7.3。分别将伊布利特纯品(由北京红惠生物制药股份有限公司提供)溶解于INa细胞外液中使伊布利特终浓度达到10-6、10-5mol/L，分别用含有两种浓度伊布利特的细胞外液灌流细胞，流速2 ml/min，大约3～5 min。胶原酶，HEPES、BSA等由Sigma公司生产,余为国产分析纯。
1.3 单细胞分离
猛击兔头颅枕部致昏，迅速开胸取心脏，置于冰冷的无钙台氏液中，剪去心包，心脏经修饰后连接在Langendorff心脏灌流装置上，经主动脉根部逆行用无钙台氏液灌流(灌注压70 mmHg，恒温36℃)10 min，用含酶液灌流16～20 min，至心脏膨大、松弛后从灌流装置上取下，先剪去心包，再从房室沟剪去心室，将剩余部分剪去大的血管，留下左右心房。用眼科剪将心房肌组织剪碎置于36℃含胶原酶Ⅰ 0.4 mg/ml的无钙台氏液中温育振荡(4 Hz)，每隔1 min取少许酶液在显微镜下观察单个脱落的心房肌细胞的形态和数量，直至有较多方正的细胞。
1.4 细胞封接与全细胞记录模式的建立
按文献〔5〕方法建立全细胞膜片钳记录模式。实验在室温(20～25℃)下进行,细胞破膜后稳定5 min开始记录电流。
1.5 细胞膜电容的记录
通道信号经HEKA EPC-9膜片钳放大器放大,电流信号由pulse+pulsefit8.53软件控制,细胞封接时由软件自动测量细胞膜电容值。
1.6 INa电流记录
1.6.1 电流-电压曲线
从维持电位(HP)-80 mV,阶跃+10 mV,从-70 mV逐步去极化到+60 mV,刺激频率1Hz,钳制时间50 ms。为消除细胞间误差,电流值以电流幅值与膜电容相比即电流密度(pA/pF)表示,以不同钳制电压下的INa峰电流密度绘成电流-电压(I-V)曲线。
1.6.2 稳态失活曲线
采用双脉冲刺激法,HP=-80 mV,条件脉冲-160～-40 mV,钳制时间1 000 ms,阶跃+10 mV,每次条件脉冲后紧跟一固定的去极化到-20 mV的测试脉冲,持续时间50 ms,刺激频率1Hz，将记录的INa与最大激活时的INa之比,与相应的条件脉冲膜电位绘制钠通道失活曲线,并通过Pulse+Pulsefit软件用Boltzmann方程自动计算出INa半数失活电压(V0.5)。
1.6.3 失活后再恢复曲线
采用双脉冲刺激法,第一个脉冲(即条件脉冲)HP=-80 mV,去极化到-20 mV,持续时间50 ms,在第1个脉冲回到HP后不同时间间隔给予第2个脉冲(即测试脉冲)去极化到-20 mV,持续时间50 ms,第2个脉冲与第1个脉冲的时间间隔开始为5 ms,增量为10 ms逐级递增至145 ms,刺激频率1 Hz。以测试脉冲与条件脉冲的INa之比与相应的时间间隔绘图,得钠通道失活后再恢复过程曲线。
1.7 统计学处理
数据以x±s表示,用SPSS10.0软件进行统计学处理,组间均数比较采用方差分析。
2 结 果
2.1 三组细胞的膜电容
三组细胞的平均膜电容分别为正常对照组(134±21) pF(n=100细胞)，10-6组为(127±20) pF(n=100细胞)，10-5组为(142±21) pF(n=100细胞)，无显著性差异，说明伊布利特对心房细胞膜电容无明显影响。
2.2 细胞的INaI-V曲线的变化
三组细胞所记录INa电流的变化见图1。对照组INa峰值电流密度为(-87.12±4.67)pA/pF(n=12细胞)，10-6组为(-45.26±3.46)pA/pF(n=11细胞)，较对照组下降了48.05%(P<0.01)，10-5组为(-33.46±3.11)pA/pF(n=11细胞)，较对照组下降了61.59%(P<0.01)。10-6与10-5组较对照组均有明显下降，10-5与10-6组相比较，INa峰值电流密度呈下降趋势，两组间有显著差异(P<0.05)。可见INa电流幅度依伊布利特浓度升高而减低。三组细胞INaI-V曲线均在-70 mV激活,-20 mV达峰值,+60 mV时反转,三组细胞INaI-V曲线的形态轨迹均一致，INa峰值电流密度呈浓度依赖性降低(图2)。
2.3 三组细胞的INa稳态失活曲线的变化
三组细胞的INa电压依赖性稳态失活曲线的变化见图3。10-6与10-5组与正常对照组相比，失活曲线明显左移(即向超极化方向移动)，以10-5组左移最明显。V0.5对照组为(-78.6±4.1)mV(n=10细胞),10-6组V0.5为(-103.3±4.5)mV(n=10细胞)，与对照组比较有显著性差异(P<0.05);10-5组V0.5为(-115.1±4.6)mV(n=11细胞)，与对照组及10-6组比较均有显著性差异(P<0.05)。
2.4 细胞的INa失活后恢复曲线
三组细胞的INa失活后再恢复过程原始电流图见图4。三组INa失活后再恢复曲线的变化见图5。10-6与10-5组使INa再恢复明显减慢，再恢复时程延长，与对照组比较有显著性差别(分别为P<0.01和P<0.001);10-6与10-5组之间比较有明显差异(P<0.05)。见表1。表1 三组在不同时间失活后再恢复的比较(略)
3 讨 论
伊布利特是新近推出的Ⅲ类抗心律失常药物，其作用机制与其他的Ⅲ类抗心律失常药不同，主要用于快速转复房颤(AF)、房扑(AFL)〔6〕。国外有相关实验〔7〕证实加入钠通道拮抗剂河豚毒(TTX)后不能缩短伊布利特所延长的APD及ERP，但不能说明伊布利特对INa没有影响。
大量临界能被激动的组织的存在，才能允许多个折返环传播，而且折返环不能遭遇前一个折返环刺激组织后的不应期，否则折返环将会消失，房颤/房扑将会终止。抗房颤/房扑药物的作用机制〔8〕一方面延长心房组织的不应期，阻断折返环在心房中的传播，而且复极延长造成兴奋性降低，折返环的可激动间隙兴奋性降低，折返环不能向前推进;另一方面通过延缓心肌传导从而延长折返环的不应期，折返环路被打断。有关电生理实验〔9〕已证实伊布利特可以延长房扑的周期长度及周期长度变异度，从而消除可激动间隙，使波峰不能向前推进，终止房颤/房扑。
本实验证实伊布利特使心房肌细胞INa峰值电流密度降低，导致0相最大上升速率(Vmax)下降〔10〕，使动作电位幅度降低，延长心房肌有效不应期、动作电位时程和QT间期，使传导减慢，兴奋性降低，阻断折返环在心房内的传播。INa失活曲线左移，说明钠通道失活状态所占比例较大，需要较强的去极化才能启动再生性钠泵，阈电位上移，兴奋性降低，兴奋性在细胞间的传导减慢，从而使细胞除极减慢，减慢传导终止折返。伊布利特明显地减慢钠通道失活后的恢复过程，使INa失活后再恢复曲线右移，且呈浓度依赖性，延迟钠通道失活后的恢复时间，这进一步说明伊布利特作用于钠通道的失活态。INa失活后再恢复减慢，亦导致心肌兴奋性的恢复延长，延长动作电位及有效不应期，减慢传导使折返环终止传播。
伊布利特干预后，心房肌细胞快钠通道电生理学特性发生了变化，我们认为伊布利特抗房颤/房扑的电生理机制之一是通过阻断INa，并进一步使：①可激活的钠通道数量减少，细胞膜的阈值降低，折返环的可激动间隙兴奋性降低;②降低动作电位振幅，减慢传导速度，终止折返;③延长心房组织的不应期，阻断折返环在心房中的传播;④延长折返环的不应期，折返环路被打断，终止房颤/房扑。由于各离子通道不是孤立存在的，心房肌动作电位的形成也是各通道平衡的结果，因此推测伊布利特干预后，决定0相除极的快钠通道活性改变是否会影响其他离子流活性。关于快钠通道活性变化是否对其他通道活性有影响及快钠通道在抗心律失常作用中所占比重尚有待进一步研究。
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