人脐血间充质干细胞鉴定及用5-氮胞苷诱导后的生物学特性研究

　　作者：黄景玲 作者单位：青海省心血管病专科医院

　　【摘要】 目的 探讨脐血间充质干细胞经体外扩增纯化表面CD标志的鉴定及在体外定向分化成心肌样细胞的诱导剂5-氮胞苷(5-aza)作用后的生物学特性。方法 健康妊娠产妇分娩的胎儿脐带血，分离单个核细胞进行培养、传代，取第3代以后细胞用流式细胞仪直接标记分析CD34、CD44、CD90细胞表面标志。10μmmol/L5-aza诱导4周后，进行透视电镜观察，并检测细胞肌球蛋白重链基因的表达。结果 体外纯化扩增后的脐血间充质干细胞含有与骨髓来源的间充质干细胞相同的细胞表面标志，第3代以后细胞纯度较高，经5-aza体外诱导培养可形成心肌样细胞。结论 脐血间充质干细胞经体外纯化扩增，第3代以后的细胞纯度较高，在体外经5-aza诱导定向分化为心肌样细胞后，其基本的生物学特性未发生改变。

　　【关键词】 脐血间充质干细胞 5-氮胞苷 生物学特性 心肌样细胞

　　APPRAISAL OF HUMAN MSCS FROM UCB AND ITS

　　BASIC BIOLOGIC CHARACTERIZATION AFTER

　　5-AZACYTIDINE TREATMENT

　　Huang Jingling

　　(Qinghai Cardiovascular Hospital)

　　Abstract Objective To Detect the human MSCs markers of CD34、CD44、CD90 in Cultured and expansived stem cells (MSCs) from umbilical cord blood (UCB) in vitro and maintain its biological characterization during expansion and to induce cardiomyogenic differentiation. Methods We have isolated single cell-derived, after the thirth-passage cells were harvested, and labeled with antibodies against human antigens CD34, CD44, CD90 as indicated and analyzed by FACS. The morphology changed under transmission electron micrograph well-organized myofilaments ties, and sarcomeres after 5-azacytidine treatment. Four weeks inducing, these cells expressed the myocardial marker of myosin heavy chain. The growth curve drawing and Flow cytometry for cell cycle analysis both UCB-derived MSCs and UCB-derived MSCs after 5-azacytidine treatment. Results After the thirth-passage UCB -derived cells is MSCs, the cells maintain their stem cell nature during expansion and differentiation into in vitro. The immunophenotype of these clonally expanded cells is consistent with that reported for bone marrow mesenchymal stem cells. Conclusion Umbilical cord blood can serve as a valuable and convenient source of cariomyocyte mesenchymal stem cells.

　　Key word UCB-derived MSCs 5-aza differentiation Biologic Bharacterization

　　干细胞体外诱导定向分化为心肌细胞的试验中，常用的诱导介质有心肌细胞的提取物、5-氮胞苷(5-aza)、二甲亚砜(DMSO)。其中有5-aza体外诱导胚胎干细胞和骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化成心肌细胞的试验报道[1-3]。我们从脐血单个核细胞 (MNC)分离培养MSCs ，纯化扩增后鉴定其表面CD标志，5-aza诱导并研究比较脐血来源的MSCs和5-aza作用后的脐血MSCs生长曲线和生长周期等基本的生物学特性。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 脐血单核细胞(MNC)的制备：收集知情同意后的健康妊娠产妇分娩的胎儿脐带血50～60 ml，脐血采集后4～12 h内用Ficoll-Paque (TBD, 天津) 淋巴细胞分离液 (1.077g/cm3)分离，制备MNC悬液。

　　1.1.2 培养基：培养基为低糖DMEM/F12 (DMEM:

　　F12=1:1; Hyclone) 加入 20% 胎牛血清FBS(fetal bovine serum Lanzhou National Hyclone Bio-Engineering Co, LTD, 兰州)、10 ng/ml bFGF因子 (TECR Incorporated, US)、100 U/ml 青霉素、 100 μg/ml的链霉素。

　　1.2 方法

　　1.2.1 脐血来源的间充质干细胞(MSCs)的培养传代：将脐血MNC接种于T-25NUCLONE培养瓶中，置于37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱中培养，每周2次半量换液，细胞80%贴壁后全量换液。传代用0.25%的胰蛋白酶+0.02%EDTA于37℃下消化(显微镜下控制消化时间)，以1：(2～3)的比例传代扩增。根据MSCs的 贴壁特性，通过换液及传代次数的增加，去除悬浮生长的造血细胞，对MSCs进行分离纯化。

　　1.2.2 MSCs表面标志CD分子的检测：收集第3代 MSCs细胞用荧光抗体小鼠抗人FITC- CD34、FITC- CD44、FITC- CD90 (BD Pharmingen公司)直标抗体标记MSCs，并做阴性对照。流式细胞仪 (FACScan， BD)检测，Cell Quest软件分析结果。

　　1.2.3 MSCs的诱导分化：用含10μmol/L的 5-aza的培养基作用24 h后，吸弃上述培养液， PBS清洗两次后加入培养基继续培养。

　　1.2.4 生长曲线观察:收集第3代 MSCs细胞和5-aza作用后的MSCs接种于24孔板中(1×104/孔)，培养基同上，每3 d计数细胞一次，共观察30 d。

　　1.2.5 细胞周期分析：分别取对数生长的以MSCs和5-aza作用后的MSCs(1×106)，70%乙醇4℃固定24 h，加50 μg/ml碘化丙锭(PI)和RNase(50μg/ml) ，在4℃条件下孵育30 min，流式细胞仪检测计数1×104 个细胞。

　　2 结果

　　2.1 两种MSC的形态特征:脐血MNC大部分48 h后可形成贴壁细胞。培养5～7 d后在形态上主要是类纤维样细胞和扁平圆形细胞两类细胞，随着时间的延长，这类扁平圆形细胞不能增殖，胰酶难以消化，不能传代。类纤维样细胞10～14 d左右可形成集落，传代到第3代后，这类细胞为均匀的长梭形细胞(见图1)。故以第3代做后面的试验。

　　2.2 脐血来源的MSCs表面CD分子的表达：第3代脐血MSCs细胞表面CD标志检测高表达CD44(阳性细胞的百分比为88.55%)、CD90(阳性细胞的百分比为93.02%)，不表达CD34(阳性细胞的百分比为0.01%)，见图2。

　　2.3 脐血来源 MSC具有向心肌细胞分化的潜能：5-aza作用后的MSCs继续培养28 d后的RT-PCR分析发现期可表达β-肌球蛋白重链(β-MHC)，见图3。透视电镜观察可见成束的肌丝等心肌细胞所具有的细胞器，见图4。

　　2.4 MSCs和5-aza作用后的细胞的生长曲线和周期分析:5-aza作用后的细胞在24 h后有一部分死亡，MSCs第 3 代细胞均2～4 d 倍增1次,1个月左右进入平台期，见图5。对数生长期 MSC体外细胞周期分析表明 ,大部分细胞( > 90 %)处于 G0/ G1期，见图6。

　　3 讨论

　　心脏是终末分化器官的观点仍然为大家公认[4]，心肌细胞在出生后不能再生。尽管在药物治疗与心脏介入治疗方面近年取得了巨大的进步，对心肌细胞数量的绝对减少的疾病，上述治疗仍然难以奏效。30年前开展的心脏移植术现在已成为广泛采用的治疗终末期心脏病的重要手段。1980年环孢素的使用使移植术后存活率升高并维持于一个恒定的水平，目前1年存活率为80%。由于受限于心脏供体的缺乏，多年来难有发展。人们开始探索以干细胞移植来修复已坏死或纤维化的心肌细胞。对各种干细胞的多潜能性和可塑性的研究，使人们意识到有可能诱导形成心肌细胞并进行大量的体外培养，以补充损伤更新丧失的心肌细胞。目前，研究者们正在积极探索对心肌进行细胞治疗的可能性。对心肌进行细胞治疗的一个关键问题是寻找充足可用于心肌细胞移植的细胞源。过去十年中，人们对MSCs进行了广泛的研究[5-9]，这些研究主要集中在骨髓中分离出的MSCs ，骨髓来源的MSCs是细胞移植研究的主要细胞。MSCs的细胞形态呈类纤维细胞样，它具有自我更新能力强、具有多向分化能力的特点。

　　本研究中，我们利用正常足月产胎儿的脐血，从脐血 MNC 成功培养出 MSCs ,其形态与骨髓来源的MSCs相同。细胞的自我更新能力强，用流式分析检测脐血来源 MSC 免疫表型无造血细胞标志CD34的表达。与其他来源的 MSCs类似 ,可表达 CD44、 CD90等黏附分子。在5-aza的作用下可以向心肌细胞分化，表明脐血MSC仍然保持着心肌干细胞的特点[11]。其中 90 %以上处于细胞周期的 G0/ G1 期，能够在体外扩增。脐血来源的MSCs与5-aza作用后的脐血MSCs生长曲线和生长周期比较，5-aza作用后的MSCs在最初的24 h有部分死亡，以后的生长曲线近似MSCs，两种细胞细胞周期分析结果相近似，说明5-aza没有改变脐血来源的MSCs的基本生物学特性。胚胎干细胞的试验存在伦理、法律、免疫排斥等一系列问题;抽取骨髓对病人来说是一个有创过程。另外有研究显示，随着年龄的增长，骨髓中有分化潜能的MSCs逐渐减少[11] 。 因此人们把来源丰富的脐血作为另一个成体MSCs。脐血中所含的细胞非常“年轻”，因而有很强的增殖、分化能力。目前，大多数时候脐血在产房中是医疗废物。本实验结果证实，从脐血中可以获得较纯化的、可克隆样扩增的、能过向心肌细胞分化的MSCs;脐血的应用得到了进一步扩展，使脐血成为继骨髓之外的另一个MSCs来源。为心肌细胞移植提供了良好的细胞供体。

　　【参考文献】

　　[1]Shinji Makino，Keiichi Fukuda. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro[J].Clinical Investigation, 1999，103：697-705

　　[2]Itescu S, Kocher AA, Schuster MD. Myocardial neovascularization by adult bone marrow-derived angioblasts: strategies for improvement of cardiomyocyte function [J]. Ann Hematol, 2002, 81:S21-S25

　　[3]Chunhui Xu, Shailaja Police,Namitha Rao，et al. Characterization and Enrichment of Cardiomyocytes Derived From Human Embryonic Stem Cells [J]. Circulation Research, 2002, 91:501

　　[4]Maclellan, W.R, and Schneider, M.D. Genetic dissection of cardiac growth control pathways[J]. 2000，Annu. Rev. Physiol, 62:289-319

　　[5]Molkentin JD, Lu JR, Antos CL, et al. A calcineurin-dependent transcriptional pathway forcardiac hypertrophy[J].Cell, 1998, 93:215-228

　　[6]Vega RB, Bassel-Duby R, Olson EN.Control of cardiac growth andfunction by calcineurin signaling[J].Biol Chem, 2003, 278:36981-36984

　　[7]De Bari C, Dell Accio F, Tylzanowski P, et al. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane[J]. Arthritis Rheum, 2001,44:1928-1942

　　[8]Sottile V, Halleux C, Bassilana F, et al. Stem cell characteristics of human trabecular bone-derived cells[J].Bone, 2002, 30:699-704

　　[9]Zuk PA, Zhu M, Ashjian P，et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J]. Mol Biol Cell, 2002, 13:4279-4295

　　[10]Mark F. Pittenger and Bradley Martin. Mesenchymal Stem Cells and Their Potential as Cardiac Therapeutics[J]. Circ. Res, 2004, 95:9-20

　　[11]D’Ippolito G, Schiller PC, Ricordi C, et al. Age-related osteogenic potential of mesenchymal stromal stem cells from human vertebral bone marrow [J]. Bone Miner Res, 1999,14:1115-1122