CrkL在β受体过度激动促进心肌梗死后心室间质重塑中的作用

　　作者：朱雪锋 李 刚 张灿晶1 作者单位：(重庆医科大学附属第一医院老年病科心血管病组，重庆 400016)

　　【摘要】 目的 探讨CrkL在β肾上腺素能受体(βAR)过度激动促进心肌梗死后心室间质重塑中的作用。方法 40只SD大鼠分为心肌梗死给药组(n=15);心肌梗死对照组(n=10);假手术给药组(n=9)以及假手术对照组(n=6)，采用左冠状动脉前降支结扎术建立心肌梗死模型，心肌梗死给药组和假手术给药组给予异丙肾上腺素，心肌梗死对照组和假手术对照组给予生理盐水处理，采用彩色多普勒超声测定射血分数(EF)及左室短轴缩短率(FS)，12 w后处死大鼠，取心脏，Masson胶原特殊染色法测定胶原容积分数(CVF)，Western印迹检测心肌梗死周围濒死组织CrkL的表达。结果 心肌梗死给药组较心肌梗死对照组EF及FS降低、CVF增高、梗死灶周围濒死组织中CrkL蛋白表达显著升高并与CVF呈正相关(P<0.05)。结论 βAR过度激动可明显增强心肌梗死后心室间质重塑，CrkL的表达增强可能是其机制之一。

　　【关键词】 心肌梗死;心室间质重塑;异丙肾上腺素;β肾上腺素能受体;CrkL

　　The role of CrkL in the effect of extracellular matrix remodeling of left ventricle of postmyocardial infarction rats byβadrenergic receptor overactuation treatment

　　ZHU XueFeng，LI Gang,ZHANG CanJing.

　　Division of Cardiology, Department of Gerontology,the First Affiliated Hospital,Chongqing 400016, China

　　【Abstract】 Objective To investigate the role of CrkL in the effect of extracellular matrix remodeling of left ventricle of postmyocardial infarction(MI)rats by βadrenergic receptor(βAR) overactuation treatment. Methods MI models were established by ligating left anterior descending coronary artery.Forty SD rats were divided into MI isoprenaline groups(n=15)and MI placebo groups(n=10), shamoperation isoprenaline groups(n=9) and shamoperation placebo groups(n=6), which were treated with isoprenaline and physiological saline respectively. Ejection factor (EF) and fractional shortening (FS) were examined by Doppler ultrasonograph. After twelve weeks ,the collagen volume fraction(CVF) was measured by Masson stained sections of cardiac muscle.The expression of CrkL protein in periinfarction zone was detected by Western blot. Results Compared with MI placebo groups rats, isoprenalinetreated MI rats changed in several features including the aggravated heart function significantly，increased CVF sharply ,and the elevated expression of CrkL protein in periinfarction zone.Furthermore,the expression of Crkl protein herein had a positive correlation with the CVF. Conclusions βAR overactuation could aggravate extracellular matrix remodeling of left ventricle in postMI rats,the elevated expression level of CrkL protein maybe one of the mechanisms.

　　【Key words】 Myocardial infarction; Extracellular matrix remodeling of left ventricle; Isoprenaline; βadrenergic receptor; CrkL

　　大量研究表明心肌梗死后心室重塑是心力衰竭发生发展的重要机制，心室重塑重要特征之一是心肌间质胶原代谢紊乱〔1〕。既往对心室重塑的研究多是在心肌梗死后给予保护性措施如β肾上腺素能受体(βAR)阻断剂来研究其机制。相反，通过在心肌梗死后进一步激动βAR探讨心室重塑机制的研究报道较少。接头蛋白CrkL(CrkL)是Crk家族成员之一，Crk表达增高可促进基质金属蛋白酶2(MMP2)及基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达，导致胶原代谢紊乱〔2〕;CrkL参与多种信号转导途径调节细胞运动、增殖及分化〔3〕，其过度表达可促进哺乳动物细胞胶原网的形成〔4〕，推测心肌梗死后出现的βAR过度激动可能通过CrkL途径促进心肌梗死后心室间质重塑。本课题在心肌梗死模型基础上加用非选择性βAR激动剂异丙肾上腺素(ISO)进一步过度激动βAR，探讨βAR过度激动与CrkL表达改变的关系以及它们对心室间质重塑的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 清洁级雄性SD大鼠40只(重庆医科大学实验动物中心提供)，体质量220±30 g，12周龄;盐酸ISO注射液(上海禾丰制药有限公司，批号国药准字H31021344);彩色多普勒超声仪Vivid7(美国GE公司);抗CrkL抗体(美国Cell Signaling Technology公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 心肌梗死模型制备及处理 40只雄性SD大鼠适应性饲养1 w后随机分为心肌梗死给药组(n=15);心肌梗死对照组(n=10);假手术给药组(n=9)以及假手术对照组(n=6)，采用左冠状动脉前降支结扎术建立心肌梗死模型，以心尖部明显发白为结扎成功的标志;相同部位只穿线不结扎建立假手术模型。其中心肌梗死给药组及假手术给药组于术后24 h开始给予ISO，剂量5 mg/kg，腹腔注射给药，以后每隔3 d给药一次至术后12 w;心肌梗死对照组及假手术对照组于术后24 h给予等体积生理盐水，方法同上。12 w时存活的大鼠样本量为心肌梗死给药组(n=10);心肌梗死对照组(n=9);假手术给药组(n=8)以及假手术对照组(n=6)。

　　1.2.2 超声心动图检测射血分数(EF)及左室短轴缩短率(FS) 由专科医生操作，采用彩色多普勒超声仪Vivid7，探头频率为7.5 MHz，各组大鼠分别于术前及术后4、8、12 w行超声心动图检测EF及FS。所有超声测定值均取5个心动周期的平均值。

　　1.2.3 心肌组织Masson染色及胶原容积分数测定 各组大鼠于造模12 w 后禁食不禁饮24 h，开胸迅速取出心脏置于4℃生理盐水中，洗净残留血液，除去心房及结缔组织，将心肌组织沿垂直心脏长轴方向分成两部分，取心底部梗死周围濒死组织置于40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片后行Masson染色，在镜下随机选取Masson染色的5个视野并应用计算机辅助图像分析系统测定胶原容积分数(CVF)，CVF为单位视野胶原纤维面积与总组织面积比值,总面积不包括血管周围的胶原面积，用于评价心肌间质纤维化的程度。

　　1.2.4 Western印迹检测CrkL的表达 取心尖部梗死周围濒死组织，经提取蛋白、电泳、转膜、封闭、一抗及二抗孵育、显色、图像分析系统采集及分析结果，以βactin为对照，计算CrkL/actin灰度比值。

　　1.2.5 统计学处理 采用SPSS10.0统计软件，计量资料以x±s表示，组间比较用方差分析，组间两两比较用q检验,相关分析用Pearson相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 超声心动图检测结果 在0及4 w时，4组大鼠之间EF及FS组间比较差异无显著性(P>0.05);在8及12 w时，假手术对照组较假手术给药组EF及FS显著降低(P<0.05)，见表1。

　　2.2 心肌组织Masson染色及CVF 光镜下心肌细胞呈粉红色，胶原呈蓝色，见图1。CVF测定结果见表2。心肌梗死给药组CVF显著高于心肌梗死对照组、假手术给药组以及假手术对照组(P<0.05);假手术给药组CVF显著高于心肌梗死对照组以及假手术对照组 (P<0.05); 心肌梗死对照组CVF显著高于假手术对照组(P<0.05)。

　　2.3 梗死区周围CrkL的表达 心肌梗死给药组CrkL的表达显著高于心肌梗死对照组、假手术给药组以及假手术对照组(P<0.05);假手术给药组CrkL的表达显著高于心肌梗死对照组以及假手术对照组(P<0.05)，见表2，图2。表1 ISO对EF及FS的影响与假手术对照组比较：1)P<0.05

　　图1 各组大鼠心肌组织Masson染色(×400)

　　表2 ISO对大鼠CVF以及CrkL表达的影响(x±s)

　　组别CVF(%)CrkL/actin心肌梗死给药组(n=10)6.54±0.201)2)3)1.20±0.191)2)3)心肌梗死对照组(n=9)4.19±0.263)0.65±0.16假手术给药组(n=8)5.87±0.261)3)0.91±0.161)3)假手术对照组(n=6)3.64±0.220.60±0.23

　　与心肌梗死对照组比较：1)P<0.05;与假手术给药组比较：2)P<0.05;与假手术对照组比较： 3)P<0.05

　　图2 各组CrkL Western印迹结果

　　2.4 CVF及CrkL表达的相关性分析 心肌梗死给药组、心肌梗死对照组以及假手术给药组CVF及CrkL表达均呈显著正相关关系(r分别为0.829、0.783、0.830，P<0.05);假手术对照组CVF及CrkL表达无相关(r=0.337，P>0.05)。

　　3 讨 论

　　大量研究表明心力衰竭发生发展的机制就是心室重塑，而心肌组织中胶原显著增加及代谢紊乱是心室重塑的主要表现之一〔5〕。心肌梗死后心力衰竭出现交感神经兴奋性增强，其中βAR兴奋性增强是其重要组成部分。既往已有研究表明βAR兴奋可以激活肾素血管紧张素系统(RAS)，可使醛固酮的分泌增加，进而醛固酮激活成纤维细胞，胶原纤维分泌增多，促进心脏间质纤维化。

　　ISO是人工合成的拟儿茶酚胺类非选择βAR激动剂，给予后可引起类似交感神经兴奋的表现，长期给予ISO可出现βAR过度激动并出现心肌细胞坏死，广泛纤维化以及残存心肌细胞肥大〔6，7〕。有文献报道〔8〕给予βAR阻断剂后可减轻ISO引起的心室纤维化，这也从反方面证实了ISO是通过兴奋βAR引起心室纤维化的。在实验的进程中为了尽量避免βAR下调及脱敏〔9〕，我们采用每隔3 d给予ISO一次的方法。

　　本研究提示，心肌梗死给药组心肌间质重塑较明显，说明在心肌梗死后给予ISO可引起βAR进一步过度激动，使心肌间质重塑更加明显，长期慢性过度激动βAR可引起CrkL表达的明显增强;对CVF及CrkL的表达行相关性分析，说明CrkL表达增高可能是过度激动βAR促进心肌梗死后心室间质重塑机制之一。活体外实验研究表明Crk表达增高可促进MMP2及MMP9的表达〔4〕，基质金属蛋白酶表达上调,一方面可使正常胶原结构被降解,另一方面是促进缺乏交联结构的不正常胶原增生,最终是心肌组织中一些结构不完整的胶原纤维沉积,胶原的过度沉积破坏了心脏的支架结构,导致心室的纤维化,使心脏的几何形态异常改变,室壁张力增高，心功能降低，最终实现心室重构〔10〕。假手术对照组CVF及CrkL表达间无相关，说明非过度激动βAR情况心肌纤维化与CrkL表达之间无明显关系。

　　综上所述，我们推测βAR过度激动促进CrkL表达的增加，并通过MMP2及MMP9导致心肌间质胶原代谢紊乱，从而加重心室间质重塑。

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