缺血后适应对心大鼠肌缺血再灌注后血流动力学改善的影响

　　作者：全南虎 郑 杨 于宏颖1 赵 昕 作者单位：(吉林大学第一医院心血管病诊疗中心，吉林 长春 130061)

　　【摘要】 目的 研究缺血后适应(ischemic postconditioning，IPO)对正常离体大鼠心肌再灌注后血流动力学的改善作用。方法 采用正常离体大鼠心脏Langendorff灌流方法，全心停灌30 min，复灌60 min复制成心肌缺血的再灌注损伤(I/R)模型，测定血流动力学指标和再灌30 min冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)含量。实验结束后分离出左心室心肌并横切成5片，置入TTC中测定心梗面积。结果 离体大鼠心肌缺血后适应干预后可显著改善再灌注后左室收缩压(LVSP)以及左心室内压最大上升速率(+dP/dtmax)等血流变学指标，并显著减少了再灌注后LDH与CK的释放量及室性心律失常的发生;同时后适应干预减少了心肌梗死面积(47.3%，29.5%)。结论 缺血后适应处理对离体大鼠缺血再灌注后的血流动力学指标损伤有明确的改善作用，预防了心肌缺血再灌注损伤。

　　【关键词】 缺血后适应;离体大鼠心脏;缺血再灌注损伤

　　急性心肌梗死(AMI)的再灌注治疗是治疗AMI的最有效治疗。但随后发生的再灌注损伤可能抵消再灌注治疗的获益。减少再灌注损伤，则可以改善患者的预后。缺血后适应(ischemic postconditioning，IPO)即在再灌注开始时，立刻给予一次或多次短暂重复的心肌缺血与再灌注，能提高心肌对之前发生的较长时间缺血的耐受性〔1〕。本研究旨在探讨后适应对离体大鼠心肌再灌注损伤的保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1.1 材料 氯化三苯基四氮唑(TTC)购于美国Sigma公司;LDH、CK、LDLC试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

　　1.1.2 实验动物及分组 成年雄性Wistar大鼠24只购于吉林大学公共卫生学院动物室，体重280～340 g。随机分为正常对照组(C组)，缺血再灌注组(I/R组，B组)，缺血后适应组(IPO组，A组)，每组8只。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠心脏离体灌注 给予大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉,固定动物四肢,随后腹腔注射500 U肝素抗凝，迅速取出心脏浸于4℃ KrebsHenseleit缓冲液;1 min内主动脉插管悬挂于Langendorff装置上;用改良KrebsHenseleit缓冲液行非循环式主动脉逆行灌流，灌流压65 mmHg,灌流液温度维持在37℃，pH 7.4,灌流液以95% O2，5% CO2混合气饱和。各组心脏平衡灌流20 min后，平衡灌注20 min内，若心率(HR)<200 次/min，或左心室收缩压(LVSP)<75 mmHg(10 pKa)，或冠脉流量(CF)<8 ml/min，或室早>2个/min者，则弃用。正常对照组全心灌流90 min;I/R组经历全心停灌缺血30 min，60 min 复灌再灌注期;IPO组经历全心停灌缺血30 min后，在再灌注一开始同样先给予再灌注10 s,全心停灌缺血10 s，6次循环，然后继续给予再灌注至60 min。改良KrebsHenseleit缓冲液成分：NaCl 118 mmol/L，NaHCO3 25 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl2 3.0 mmol/L，MgSO4 1.2 mmol/L，Glucose 11.0 mmol/L，pH 7.4。

　　1.2.2 血流动力学检测心功能 将1个连接于压力换能器的球囊插入左心室,连接囊的导管内充满生理盐水(事先应排尽空气);压力换能器的另一端接于八道生理记录仪RM6000，由其来记录左心室内压力的变化。分别于缺血前、缺血30 min、再灌注1 h记录LVSP和HR、CF、左心室内压最大上升速率(+dP/dtmax)及室性心律失常发生率。

　　1.2.3 冠脉流出液测定指标 收集平衡灌流20 min、再灌注30 min的冠脉循环流出液，半自动分光光度仪测定乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)。

　　1.2.4 测定心梗面积 再灌注60 min后迅速从Langendorff装置上取下心脏，分离出左心室心肌并横切成5片，置入TTC中，37℃水浴15 min;非坏死区染成砖红色，坏死区不染色呈灰白色;置入10%中性甲醛固定过夜。然后分离坏死区和非坏死区后称重，梗死范围以坏死心肌质量占左心室心肌质量的百分比表;数码照像后电脑软件IMAGE TOOL分析梗死范围。

　　1.3 统计学处理 数据资料以x±s表示，用SPSS10.0软件分析，组内比较用配对t检验，组间比较采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 血流动力学指标 C组与其他两组离体大鼠心脏在平衡期血流动力学指标无明显差异(P>0.05)。全心灌流90 min内血流动力学无明显变化;B组经缺血30 min、再灌30 min时、CF、HR、LVSP、+dP/dtmax均明显降低(P<0.05);A组CF、HR、LVSP、+dP/dtmax下降幅度 表1 各组离体大鼠心脏血流动力学改变与C组比较：1)P<0.05;与B组比较：2)P<0.05

　　2.2 冠状动脉流出液LDH,CK含量 缺血再灌注前，平衡期各组冠状动脉流出液LDH、CK含量差别无统计学意义(P>0.05)。缺血再灌注30 min后，B组LDH、CK分别升高10倍和13倍;A组再灌30 min后，LDH、CK分别升高6倍和7倍;差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

　　2.3 再灌注后室性心律失常发生情况 B组发生室性心律失常(多发室性期前收缩、室性期前收缩呈二连律或室性心动过速)6例，A组1例，差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.4 心肌梗死范围 B组心肌梗死范围为47.3%，A组为29.5%，较B组明显减小(P<0.05)。见图2。

　　3 讨 论

　　本研究显示，离体大鼠心脏后适应干预后可显著改善再灌后LVSP以及+dP/dtmax等血液流变学指标，并显著减少了再灌注后LDH与CK的释放量及室性心律失常的发生;同时缺血后适应处理减少了心肌梗死的面积(47.3%、29.5%)。关于心肌缺血后适应保护心肌的机制，在Zhao等〔1，2〕初期研究中认为缺血后适应通过减少氧自由基生成过多和后适应概念，即再灌注后立刻给予1次或多次短暂重复心肌缺血与再灌注，可改善心肌血流动力学状态,从而减轻水肿和内皮的损伤，起到保护心肌的作用。Yang等〔3〕研究认为在缺乏中性粒细胞等血液成分的情况下,仅用缓冲液灌注心脏进行缺血后适应的干预研究,这种保护作用仍然可以发生,由此认为,缺血后适应可能对心肌细胞施加直接作用。考虑到在体实验过程中存在神经调节和机体整体反射活动的参与,本实验在离体大鼠心脏模型上,排除神经因素和机体整体反射活动的影响,观察缺血后适应处理对缺血再灌注心肌的保护作用。实验结果证实：缺血后适应能够减轻心肌再灌注损伤，表现为心肌梗死面积减小和血流动力学指标改善及心肌酶释放减少,与近几年的研究结果相一致〔4～7〕。已有研究显示：缺血后适应处理直接引起细胞内激酶的变化，即通过再灌注损伤救援激酶(RISK)信号传导通路，激活PI3KAkt、ERK、GSK3β等激酶而起到保护心肌的作用〔6，7〕。本研究在离体大鼠心脏上成功建立了稳定的后适应缺血再灌注模型，为进一步研究后适应细胞内信号通道的作用机制以及糖尿病的心肌缺血后适应保护作用奠定了基础。

　　【参考文献】

　　1 Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME,et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003;285(2):57988.

　　2 Tsang A，Hausenloy DJ，Mocanu MM,et al.Postconditioning：a form of “modified reperfusion” protects the myocardium by activating the phosphatidylinositol 3kinaseAkt pathway〔J〕.Circ Res，2004;95(3);2302.

　　3 Yang XM，Philipps S,Downey JM,et al.Postconditioning′s protection is not dependent on circulating blood factors or cell but requires PI32kinase and guanylyl cyclase activation〔J〕.Basic Res Cardiol,2005;100(1):5763.

　　4 Argaud L，GateauRoesch O，Raisky O,et al.Postconditioning inhibits mitochondrial permeability transition〔J〕.Circulation，2005;111(2)：1947.

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　　6 Bouhidel O，Pons S，Souktani R,et al.Myocardial ischemic postconditioning against ischemiareperfusion is impaired in ob/ob mice〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008;295(4):15806.

　　7 Pinheiro BB，Fiorelli AI，Gomes OM. Effects of ischemic postconditioning on left ventricular function of isolated rat hearts〔J〕.Rev Bras Cir Cardiovasc，2009;24(1):317.