原代培养乳鼠窦房结细胞的形态学及表面抗原研究

　　作者：管思彬，马爱群，蒋文慧 作者单位：西安交通大学医学院：1. 第一附属医院心血管内科;2. 高护系，陕西西安 710061

　　【摘要】目的 建立乳鼠窦房结细胞(SNC)的体外分离纯化培养方法，了解SNC的形态结构特点，观察表面抗原超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因4(HCN4)和缝隙连接蛋白45(Cx45)的细胞表达特点，为细胞生物起搏的深入研究提供一定实验依据。方法 取新生SD乳鼠的窦房结组织，胰酶逐次消化，并予差速贴壁及5溴脱氧尿嘧啶核苷(5BrdU)纯化处理进行原代窦房结细胞的培养。结果 在培养的窦房结细胞中可观察到3种形态的细胞，即梭形细胞、三角形细胞和多边形细胞，其中梭形细胞所占比例最大，搏动频率最快，细胞器不发达，肌原纤维稀少，表达HCN4和Cx45;三角形细胞微量表达Cx45。结论 ①胰酶消化法结合差速贴壁及5BrdU处理，是可靠的窦房结细胞纯化培养技术;②搏动频率最快、HCN4和Cx45表达阳性的梭形细胞可能系窦房结起搏细胞。

　　【关键词】 窦房结细胞 细胞培养 HCN4

　　Study on morphology and surface antigen of primary cultured　neonatal rats sinoatrial node cells

　　GUAN Sibin, MA Aiqun, JIANG Wenhui

　　1. Department of Cardiovasology, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061; 2. Department of Nursing,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China

　　ABSTRACT: Objective To understand morphological characteristics of sinoatrial node cells (SNCs) by taking purified isolation and culture of neonatal rats SNCs in vitro and to understand the expression characteristics of surface antigens hyperpolarization activated cyclic nucleotide gated cation channel 4 (HCN4) and connexin 45 (Cx45) on SNCs. Methods The SNCs were isolated from sinus node tissues removed from neonatal rats by trypsin and purified cultured with differential attachment and 5bromodeoxyuridine (BrdU) treatment. Results Three different types of cells were observed among the purified cultured SNCs: spindle, triangular and irregular cells. The spindle cells took up the greatest proportion, had the fastest beats, and had less developed organelle and scarce muscular fibrils. Immunofluorescence staining was positive against HCN4 and Cx45 on the spindle cells. Small amounts of HCN4 was observed on triangular cells. Conclusion ① Isolation by trypsin combined with differential attachment and BrdU treatment is a reliable approach to culturing sinoatrial node cells. ② The spindle cells with the fastest beats and positive expressions of HCN4 and Cx45 may be the sinus node pacemaker cells.

　　KEY WORDS: sinoatrial node cell; cell culture; HCN4

　　心脏生物起搏已成为治疗窦房结病变所致缓慢型心律失常中的研究热点，其中关键是改善、恢复窦房结功能甚至重建窦房结。因而，了解窦房结细胞特别是窦房结起搏细胞的形态、抗原表达及功能特点可以更好的对其进行修复与替代。近年来关于窦房结细胞的培养已有若干报道[13]，但细胞表面抗原的研究较少，故本研究通过对原代培养的乳鼠窦房结细胞进行形态学及表面抗原观察，旨在更好的了解窦房结细胞的特性，以期为生物起搏的研究提供一定实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物

　　出生24～36h SD乳鼠，雌雄不限，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。4周龄SD雌性大鼠，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

　　1.1.2 仪器与试剂

　　SZ61型解剖显微镜、CK40型倒置生物显微镜、BX51型荧光生物显微镜(均为Olympus公司)、胰蛋白酶(Amresco公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、DMEM高糖培养基(GIBCO公司)、5溴脱氧尿嘧啶核苷(5BrdU，Sigma公司)、正常山羊血清(武汉博士德公司)、兔抗大鼠HCN4多克隆抗体(Alomone公司)、小鼠抗大鼠Cx45单克隆抗体(Chemicon公司)、山羊抗小鼠IgGTRITC荧光二抗及山羊抗兔IgGFITC荧光二抗(北京中衫金桥生物技术公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 乳鼠窦房结细胞的原代培养

　　取出生24～36h SD乳鼠20只，仰卧固定，消毒并暴露心脏，在解剖显微镜下，于界嵴中部静脉窦侧、前腔静脉根部取0.8mm×0.8mm×0.8mm组织块;组织块置于DMEM液中，吹打清洗1min×2次，剪碎后加入0.6g/L胰酶，尖嘴吸管轻轻吹打1min，置于37℃水浴震荡12min，再吹打1～2min，自然沉淀，弃去上清液;再加0.6g/L胰酶，吹打1min，37℃水浴震荡9min，再吹打1～2min，自然沉淀，吸取上清液，移入离心管，加等体积高糖DMEM培养液(含100mL/L胎牛血清);重复消化3～4次至组织块基本消化成单细胞为止;细胞悬液离心，弃上清液，再用DMEM培养液洗涤细胞一次，离心，弃上清液;加入DMEM培养液(含136mL/L胎牛血清)，打散细胞团为单细胞悬液，调整细胞数为1×105个/mL，将单细胞悬液接种于培养瓶中;将培养瓶至于37℃、50mL/L CO2孵箱中培养2h后，应用差速贴壁分离技术，吸取培养瓶中的细胞悬液，收集至另一培养瓶或预先置有盖玻片(8mm×8mm)的6孔培养板中，加入5BrdU使其终浓度为0.1mmol/L，并继续培养，每1～2d换液1次，每次加入0.1mmol/L的5BrdU。

　　1.2.2 培养细胞的形态学观察

　　光镜观察：观察细胞形态，以手控计数器记录细胞收缩频率。透射电镜观察：培养5d后，倒置显微镜下选定培养板中长有细胞的盖玻片，取出后PBS洗涤、25mL/L戊二醛固定后送电镜室梯度脱水、包埋、切片，用透射电镜对超薄切片进行观察。

　　1.2.3 培养细胞的免疫荧光观察

　　取培养5d的乳鼠窦房结细胞进行HCN4和Cx45检测，随机分为HCN4和Cx45组。吸除培养孔中的培养液，PBS清洗2次;每孔细胞用40g/L多聚甲醛液室温固定20min，PBS液清洗3次;小心取出每孔盖玻片，置于载玻片上，各自滴加正常山羊血清，37℃ 30min，甩去多余液体;滴加适当稀释的一抗(HCN4为1∶200，Cx45为1∶2000，均用0.01mol/L PBS代替一抗作为阴性对照)，4℃过夜，PBS液清洗3次;HCN4组滴加山羊抗兔 IgGFITC(1∶100)，Cx45组滴加山羊抗小鼠IgGTRITC(1∶100)，37℃ 30min，PBS洗3次;300mL/L缓冲甘油封片;用BX51型荧光生物显微镜进行观察。FITC在490～495nm激发，在520～530nm发射黄绿色荧光。TRITC在550nm激发，在570nm发射红色荧光。

　　1.2.4 统计学处理

　　共记录18个样本，观察30个高倍视野，实验数据以±s表示，采用SPSS10.0统计软件，进行单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 光镜观察结果

　　细胞培养至第5天，经倒置显微镜观察，见培养的窦房结细胞有3种形态，即梭形、三角形与不规则形，其中梭形细胞最多，搏动频率最快(图1、表1)。表1 培养细胞的形态大小、搏动频率及所占比例(略)

　　2.2 电镜观察结果

　　①梭形细胞：细胞核较大，核仁明显，线粒体少，内质网、高尔基复合体不发达，糖原颗粒不丰富，肌原纤维不发达，仅见微量成束肌微丝在核周分布，未见完整肌节及Z线(图2A)。②三角形细胞：线粒体丰富，内质网、高尔基复合体发达，糖原颗粒丰富，肌原纤维丰富，一般与细胞长轴平行, 有完整的肌节、Z线(图2B)。

　　2.3 细胞免疫荧光观察结果

　　HCN4组：在梭形细胞，HCN4抗原主要分布在胞膜上，表现为大小不一、较为连续的荧光团或荧光点，在胞质中有微量的分布(图3A);在三角形细胞，未见明显HCN4表达。Cx45组：在梭形细胞，Cx45抗原主要分布在胞膜上，表现为大小不一、不连续的荧光团、斑片状或散在的荧光点(图3B);在三角形细胞：Cx45抗原分布稀少，在胞膜上呈不连续的、大小不一的荧光点(图3C)。

　　3 讨论

　　3.1 乳鼠窦房结细胞的取材

　　对乳鼠窦房结准确定位、取材是进行窦房结细胞培养的关键步骤之一，本研究参照了MARVIN等[4]的方法，在解剖显微镜下于界嵴中部静脉窦侧、上腔静脉根部心外膜下取材进行窦房结细胞培养，实验结果示，所培养细胞中梭形细胞所占比例为65%左右，与国内外文献报道的结果近似，表明本法取材较为可靠。当然，本实验中未能获取乳鼠窦房结的具体直径，故而在实际取材中，所取组织边缘不可避免会附带一些上腔静脉和右心房壁组织，但由于这些细胞所占比例少，对实验结果影响不大。

　　3.2 窦房结细胞的分离与培养

　　近年来关于窦房结细胞的消化分离的方法有若干报道，但各研究者的方法有所差异，对于不同实验动物亦有其各自的特点。本实验借鉴了张炎[1]的方法，利用0.6g/L胰酶消化9～12min后吹打1～2min静置沉淀，多次消化分离的方法成功将组织块基本完全分离成单个细胞，同时采用了差速贴壁技术与5BrdU处理相结合的方法去除杂质细胞、提高梭形细胞的纯度。5BrdU可通过竞争取代胸腺嘧啶脱氧核苷，抑制DNA复制。已有研究证实5BrdU可显著抑制培养骨骼肌与心肌细胞中的成纤维细胞，且对心肌细胞无毒性与抑制作用，可以显著提高培养细胞中心肌细胞所占比例。另外，在心肌细胞的常规原代培养过程中发现，成纤维细胞较心肌细胞贴壁速度快，大部分成纤维细胞能在较短时间内(30～60min)完成贴壁过程。因而SONG、王庆志等[23]在窦房结细胞培养研究中也应用了5BrdU及差速贴壁的纯化培养方法，结果梭形细胞所占比例较常规培养方法有明显的提高，说明此法是窦房结细胞培养的一种较好的方法。

　　本研究综合应用胰酶逐次消化结合差速贴壁及5BrdU纯化处理进行乳鼠窦房结细胞的原代培养，多次重复试验，结果证明此法可以稳定的获得较高比例的窦房结细胞，为以后生物起搏的进一步研究提供了一定试验基础。

　　3.3 窦房结细胞的鉴定

　　3.3.1 形态学

　　由于窦房结位置的特殊性，内部细胞结构的复杂性，不同种属、不同年龄的动物，不同的实验条件和研究者，对窦房结细胞培养观察结果有一定差异。关于培养出来的细胞的形态、大小、何种细胞为窦房结起搏细胞，尚未形成较统一的参照标准。

　　本研究中用倒置显微镜观察到：刚接种时，细胞多为清亮的圆形，差速贴壁培养36h后，可见有细胞搏动，频率不一，多数细胞为小的梭形。3d后主要有梭形、三角形和多边形3种形态。梭形细胞数目最多，达(65±4)%，搏动频率最快，达(155±6)次/min，光镜下胞质颜色较深，与MARVIN[4]、赵璧君[5]等的报道相似，电镜结果与SONG等[2]的结果相近，梭形细胞的光镜、电镜结果符合窦房结P细胞“小而空”的定义。而三角形细胞的光镜、电镜结果与SONG等研究中的心房肌细胞相似，考虑为取材时夹杂的心房肌细胞。

　　3.3.2 抗原标记

　　HCN4：窦房结细胞具有特殊的电生理信号，其动作电位在舒张期发生自动去极化，这与起搏电流密切相关，而超级化激活的阳离子电流，即If电流是其重要组成部分。超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因(HCN)是编码If电流的基因。已经明确存在4种HCN通道基因的亚型，分别为HCN1～HCN4。不同亚型HCN表达量在不同动物种属和组织种类中存在很大差异。HCN1、HCN2和HCN4在心脏表达丰富，在各种动物窦房结细胞中，HCN 4的比例均最高，占HCN总表达量的80%以上。本研究中，应用抗HCN4多克隆抗体对培养的窦房结细胞进行免疫荧光标记，发现在梭形细胞胞膜上有较为连续的荧光团，但是由于未行其他HCN亚型的免疫标记，所以无法明确其各自所占比例。

　　本研究中，仅在梭形细胞观察到HCN4荧光的表达，而在三角形细胞以及多边形细胞中未发现表达荧光(三角形细胞可能系心房肌细胞)，这与已有的文献报道有些出入，国内外均有研究指出，在心房肌中可以检测到HCN4 mRNA的表达[67]。可能原因为：①动物种属的差别;②可能与使用的是单克隆抗体或多克隆抗体有关;③没有免疫标记并不意味着就不存在，可能心房肌中HCN4较小，若低于免疫标记的底线就不会有表达。

　　Cx45：缝隙连接广泛分布于各种动物组织细胞之间，耦联细胞间相互通讯，包括代谢耦联和电耦联。心肌细胞的同步收缩就是通过它来完成。心脏中各种Cx 分布有区域性变化，这有助于形成正常心肌冲动扩布的各向异性和心房、心室规则的收缩和舒张。

　　本研究中，应用抗Cx45单克隆抗体对培养的窦房结细胞进行荧光标记，发现在梭形细胞中，Cx45免疫信号主要分布在胞膜上，表现为大小不一、不连续的荧光团、斑片状或散在的荧光点，胞浆中有微量分布。此结果支持大鼠窦房结细胞中主要表达Cx45的结论[8]。本研究在三角形细胞有Cx45荧光表达，这与国内报道有别[9]，考虑与抗体选择以及标记底线有关。

　　不同种属动物Cx在窦房结细胞中的分布有差异，目前报道也不完全一致，在心脏组织中Cx主要有Cx43、Cx45和Cx40，也有报道认为存在Cx37、Cx46等[9]。DAVIS等[10]研究发现在人类窦房结组织中主要以Cx45为主，Cx40主要位于传导束、房室结及窦房结内，而Cx43主要位于心室及心房肌间。COPPEN等[11]通过研究兔窦房结细胞Cx，认为窦房结组织中以Cx45为主，Cx43在PP、PT细胞间呈阴性表达，在T心肌细胞呈阳性表达。HONJO等[12]通过免疫共聚焦技术证实窦房结细胞同型Cx的表达和在相关区域Cx密度大小的关系，结果表明窦房结细胞的投射区小于800μm2部位缺少标记的Cx43，但有高水平的Cx45和低水平的Cx40;窦房结细胞的投射区在800μm2至1200μm2的部位有低量的Cx45和Cx40标记，但有大量的Cx43标记。

　　目前仍有学者对窦房结内是否存在GJ存有质疑，有报道在窦房结仅见中间连接和不典型桥粒连接，未见GJ[13]。近年来，用免疫电镜、免疫荧光、电生理技术等均证实窦房结内有GJ和Cx[14]，本实验结果也支持在窦房结组织中存在GJ的观点，这可能与窦房结细胞中桥粒这样的闰盘力学结构不甚发达，而电学结构相对完善的特性有关。

　　本研究对乳鼠窦房结细胞进行了形态学和表面抗原观察，研究结果提示，所培养的细胞中，搏动频率最快、HCN4和Cx45表达阳性的梭形细胞为窦房结起搏细胞，即P细胞，但由于未进行电生理功能测定，故不能下定论，有待于进一步研究以明确。

　　综上所述，有关窦房结细胞的分离培养方法及其形态和免疫学特征，国内外已有若干报道，本实验借鉴其相关技术，成功建立体外窦房结细胞培养体系，获得了较高比例的梭形细胞，并从形态学和免疫细胞化学方面进行鉴定，为细胞生物起搏的研究提供了一定实验依据。

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