脑心通对人THP1单核源性巨噬细胞清道夫受体表达的影响

　　作者：刘倩，王东琦，雷新军，崔长琮，李红兵，刘胜强 作者单位：西安交通大学医院院第一附属医院心内科，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 以阿托伐他汀为标准对照，研究中成药脑心通对人THP1单核源性巨噬细胞清道夫受体CD36和SRA表达的影响。方法 人THP1单核源性巨噬细胞与50mg/L oxLDL共培养0、8、16、24h，流式细胞术检测各时间点细胞表面清道夫受体CD36和SRA的表达。不同浓度脑心通(0.125、0.25、0.5、1g/L)和1μmol/L阿托伐他汀分别干预THP1单核源性巨噬细胞12h后换液，分别加入上述浓度药液及50mg/L oxLDL孵育24h，检测CD36和SRA的表达量，统计分析不同浓度脑心通及1μmol/L阿托伐他汀对CD36和SRA表达的影响。结果 oxLDL明显促进人THP1单核源性巨噬细胞CD36和SRA的表达;脑心通呈剂量依赖性抑制CD36和SRA的表达，1g/L脑心通作用最为明显(分别降低22.3%、25.0%，P<0.05);1μmol/L阿托伐他汀显著抑制两者表达(分别下降63.3%、70.5%，P<0.05)。结论 中成药脑心通有轻度抑制THP1单核源性巨噬细胞清道夫受体表达的作用，此作用弱于阿托伐他汀。

　　【关键词】 THP1巨噬细胞;脑心通;CD36;SRATHP1

　　monocytederived macrophagesLIU Qian, WANG Dongqi, LEI Xinjun, CUI Changcong, LI Hongbing, LIU Shengqiang

　　(Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To investigate the effect of Chinese prepared medicine Naoxintong on scavenger receptors CD36 and SRA expression of human THP1 monocytederived macrophages. Methods Human THP1 monocytederived macrophages were coincubated with 50mg/L oxLDL for 0h, 8h, 16h and 24h. Cell surface scavenger receptors CD36 and SRA expression were assessed by flow cytometry. Human THP1 monocytederived macrophages were separately coincubated with differernt concentration of Naoxintong (0.125g/L, 0.25g/L, 0.5g/L and 1g/L) and 1μmol/L Atorvastatin for 12 hours. After the medium was changed, the abovementioned drugs and 50mg/L oxLDL were added and incubated with the cells for 24 hours. CD36 and SRA expressions were respectively assessed. The effects of Naoxintong and Atorvastatin on CD36 and SRA expressions were analyzed. Results oxLDL promoted CD36 and SRA expression obviously. Naoxintong inhibited CD36 and SRA expression slightly in a dosedependent manner. The effect of 1g/L Naoxintong group was most significant (respectively decreased by 22.3% and 25%, P<0.05). 1μmol/L Atorvastatin inhibited the above two expression obviously (respectively decreased by 63.3%, and 70.5%, P<0.05). Conclusion Chinese prepared medicine Naoxintong inhibits the scavenger receptor expression of THP1 monocytederived macrophages slightly, and this effect is weaker than that of Atorvastatin.

　　KEY WORDS: THP1 monocytederived macrophages; Naoxintong; CD36; scavenger receptorA (SRA)

　　现今认为动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种慢性增生性炎症反应过程[1]，是炎细胞(主要是单核巨噬细胞)吞噬“入侵”动脉壁的“病原性”脂蛋白即氧化低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein, oxLDL)的慢性炎症反应过程[23]。在诸多病理条件下(高脂血症、高血压、糖尿病等)，血液中的低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein, LDL)沉积在血管内皮下，并被氧化修饰成具有毒性的oxLDL。血液中的单核细胞在强致炎因子oxLDL的刺激下，活化并迁移进入内皮下，变成有吞噬作用的巨噬细胞，巨噬细胞吞噬oxLDL形成泡沫细胞。这是机体正常的防御机制，但泡沫细胞堆积启动了AS的发生。巨噬细胞表面有一类糖蛋白受体，可以特异性的识别并结合oxLDL，称为清道夫受体(scavenger receptor)。其中清道夫受体A(scavenger receptorA, SRA)和CD36(cluster of differentiation 36)是目前研究最多的两种清道夫受体，两者均介导巨噬细胞吞噬oxLDL。SRA和CD36的表达量与泡沫细胞的多少及AS的发展进程有密切关系。

　　脑心通是经国家药监局批准，由咸阳步长集团生产的中成药。由黄芪、丹参、当归、川芎、红花、乳香、桂枝、全蝎、地龙、水蛭等药物制成，具有益气活血、化瘀通络的作用。大量临床研究证实脑心通在AS相关疾病的防治方面有一定作用[46]。本实验对比观察脑心通与阿托伐他汀干预THP1单核源性类泡沫细胞前后，清道夫受体表达的变化情况，探索脑心通是否通过调节清道夫受体表达起到抗AS的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要实验仪器与试剂 CO2培养箱(Heraecus);流式细胞仪(Becton Dickinson);酶联免疫测定仪(Clini Bio);25cm2培养瓶和直径60mm的培养皿(Corning);oxLDL(蛋白含量：1g/L，中国医学科学院基础所生化室);THP1单核细胞株(中科院上海细胞所);RPMI1640培养基(Gibco);胎牛血清(FCS，杭州四季青);佛波酯(PMA，Sigma);牛血清白蛋白(BSA，上海长征);阿托伐他汀(辉瑞制药);脑心通(步长集团，参照日本YAMASHIKI等的方法置备粗提液[7]);FITCanti humanCD36抗体及PEanti humanSRA抗体(eBioscience)。

　　1.2 THP1单核源性巨噬细胞的培养与分组 THP1单核细胞在含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中，于37℃、50mL/L CO2条件下静置培养。取对数生长期细胞，密度调至1.0×109/L，加入终质量浓度为100μg/L的PMA，无血清孵育24h，待悬浮细胞转变为贴壁、有伪足的巨噬细胞后，弃上清，预温PBS轻洗2次，按照以下分组进行实验：①oxLDL组：50mg/L oxLDL与细胞共培养不同时间(0、8、16、24h);②脑心通组：0.125g/L、0.25g/L、0.5g/L、1g/L的脑心通分别干预细胞12h后，弃上清，分别加入上述浓度药液及50mg/L oxLDL，孵育24h;③阿托伐他汀组：1μmol/L阿托伐他汀干预细胞，方法同脑心通组。

　　1.3 流式细胞术检测细胞表面CD36及SRA蛋白的表达 按上述分组方法处理细胞，各组分别收集1×106个细胞，800r/min，离心5min，4℃ PBS洗2次。CD36检测采用直标法：用200μL含5mL/L BSA和饱和剂量FITCantiD36(5×105个/20μL)的PBS重悬细胞，室温下避光30min，流式细胞仪检测荧光强度。SRA检测方法同CD36。

　　1.4 统计学处理 各组数值以±s表示，各组均数间比较采用单因素方差分析，方差分析后用SNK法进行各组间两两比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 oxLDL上调细胞表面CD36的表达 oxLDL分别与细胞共孵育0、8、16、24h，流式细胞仪检测显示CD36相对荧光强度分别为(5.24±0.03)%、(9.36±0.02)%、(13.12±0.01)%、(15.24±0.04)%(图1)，oxLDL呈时间依赖性促进CD36表达。oxLDL作用24h CD36相对荧光强度为0h的3倍。

　　2.2 oxLDL上调细胞表面SRA的表达 oxLDL分别与细胞共孵育0、8、16、24h，流式细胞仪检测显示SRA相对荧光强度分别为(5.13±0.04)%、(10.89±0.02)%、(14.52±0.02)%、(19.67±0.04)%(图2)，oxLDL呈时间依赖性促进SRA的表达。oxLDL作用24h SRA相对荧光强度为0h的3.8倍。

　　2.3 不同浓度脑心通与1μmol/L阿托伐他汀对细胞表面CD36表达的影响 以oxLDL单独作用24h为对照组，观察不同浓度脑心通及1μmol/L阿托伐他汀对细胞表面CD36表达的影响，结果以相对荧光强度表示(%)，各组数据呈正态分布且方差齐，方差分析各组间有显著性差异。实验表明脑心通呈剂量效应下调细胞表面CD36的表达，但此作用弱于阿托伐他汀(表1)。

　　2.4 不同浓度脑心通与1μmol/L阿托伐他汀对细胞表面SRA表达的影响 以oxLDL单独作用24h为对照组，观察不同浓度脑心通及1μmol/L阿托伐他汀对细胞表面SRA表达的影响，结果以相对荧光强度表示(%)。各组数据呈正态分布且方差齐，方差分析各组间有显著性差异。实验表明脑心通呈剂量效应下调细胞表面SRA的表达，但此作用弱于阿托伐他汀(表2)。表1 脑心通与阿托伐他汀对CD36表达的影响表2 脑心通与阿托伐他汀对SRA表达的影响

　　3 讨 论

　　目前，许多中药复方的药理研究仅限于整体动物观察，没有从细胞和分子水平上进行深入系统的研究，使得中药复方在现代科学面前无法证明其科学性。所以，借鉴西药研究的经验，利用科学手段研究中药复方的作用原理，不仅对论证中医药理论有重要的意义，而且可以发挥传统医药资源优势，为新药研发开拓新的途径[8]。目前，中药体外研究主要有粗提物直接添加法和含药血清法。日本近年采用了粗提物直接添加法对中药复方小柴胡汤进行了体外药理研究，引起了国际社会的关注[7]。粗提物添加法有质控好、易于重复、充分反映药效、稳定的量效关系等优点[9];而药物血清法无法排除血清的干扰及不同来源个体血清间的差异，成份过于复杂，增加了质控难度[1011]。故在本实验中采用脑心通粗提物直接添加的方法，利用流式细胞技术探索脑心通是否影响巨噬细胞清道夫受体的表达。

　　清道夫受体是一类糖蛋白受体家族，组织分布广泛，具有广泛的配基识别谱，巨噬细胞上有大量清道夫受体表达。已知清道夫受体与动脉粥样硬化、宿主防御、细胞黏附、细胞增殖以及细胞凋亡均有不同程度的关系[12]。在oxLDL存在时，巨噬细胞通过清道夫受体特异性识别并吞噬oxLDL，形成泡沫细胞。动脉管壁内大量泡沫细胞聚集促使脂纹形成，出现AS的早期病理改变[1]。

　　在抗AS的药物中，他汀类药物不仅有调脂功能，还有抗氧化、抗炎、抑制血小板聚集等多方面作用。本研究将脑心通的作用效果与阿托伐他汀作比较，可以更确切的了解脑心通的作用强度。

　　本实验结果证实，oxLDL呈时间依赖性上调THP1源性巨噬细胞表面CD36及SRA的表达，这与以往报道一致[1314]。阿托法伐他汀明显抑制两者的表达，较对照组分别降低了63.3%和70.5%。脑心通轻度抑制两者表达，并呈剂量依赖性，1g/L脑心通使CD36及SRA表达分别降低22.3%和25%，大约是阿托伐他汀的1/3。

　　脑心通具有益气活血、化瘀通络的功效，还有取材方便，价格便宜的优点。目前，已证实脑心通对冠心病心绞痛、缺血性脑卒中等AS相关疾病有一定疗效[46]。本研究证实脑心通有轻度抑制CD36及SRA表达的作用，提示脑心通有可能通过此机制延缓动脉粥样硬化进程。

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