大鼠慢性心力衰竭急性应激模型的建立及评价

　　作者：张晓霞，吴学思，韩志红，米树华 作者单位：首都医科大学附属北京安贞医院：1. 特需医疗科，2. 心内科，北京 100029

　　【摘要】 目的 建立慢性心力衰竭急性应激状态的大鼠模型并进行评价。方法 Wistar大鼠反复腹腔注射阿霉素导致慢性心力衰竭，6周时行血流动力学和病理学评价。慢性心衰大鼠给予细菌脂多糖腹腔注射导致急性应激状态，测定血压、心率及血红素氧合酶1(HO1)的表达。 结果 阿霉素腹腔注射成功制备出慢性心力衰竭大鼠模型。与正常组相比，模型组大鼠心脏出现心肌纤维化和心肌细胞肥大，左心室收缩与舒张的最大速率(±LVdp/dtmax)明显下降。细菌脂多糖腹腔注射成功导致心衰大鼠发生急性应激，注射后0.5h心率加快，血压开始上升，1h达高峰;注射后6h HO1表达升高，12h升高更为显著，心衰大鼠较正常组大鼠升高更显著。结论 细菌脂多糖腹腔注射可成功导致阿霉素心衰大鼠产生急性应激状态，为慢性心衰急性发作的病理状态的研究提供了可靠的动物模型。

　　【关键词】 慢性心力衰竭;应激;血红素氧合酶;大鼠

　　acute stress during chronic heart failureZHANG Xiaoxia1, WU Xuesi2, HAN Zhihong2, MI Shuhua1

　　(1. Department for VIP; 2. Department of Cardiovascular Medicine,

　　Anzhen Hospital Affiliated to the Capital University of Medicine, Beijing, 100029, China)ABSTRACT: Objective To establish the rat model of acute stress during chronic heart failure and evaluate it. Methods Male Wistar rats were injected adrimycin (ADR) via abdominal cavity to induce heart failure. Cardiovascular dynamics and heart pathology were measured. Rats with heart failure received bacterial lipopolysaccharide (LPS) 0.2mg/kg by peritoneal injection to induce acute stress, and we measured blood pressure, heart rate and the expression of HO1 after LPS injection. Results ADR peritoneal injection led to heart failure successfully. Compared with that in normal group, left ventricular function (±LVdp/dtmax) of rats in model group reduced significantly, and myocardial fibrosis and hypertrophy occurred, too. LPS peritoneal injection led to acute stress in rats with heart failure. Heart rate and blood pressure began to rise 0.5h after LPS injection and reached at 1h after LPS injection. The expression of myocardium HO1 increased at 6h and was significantly higher at 12h after LPS injection. The expression of HO1 was higher in model group than in normal group. Conclusion LPS peritoneal injection successfully leads to acute stress in rats with heart failure, providing a reliable model for study of decompensated heart failure.

　　KEY WORDS: chronic heart failure; stress; heme oxygenase; rat

　　慢性心力衰竭是严重危害人类健康的疾病。由于病程较长，不可避免地会遇到许多应激刺激，如感染、液体过负荷等，导致心衰的急性失代偿，并加速心室重塑的进展，严重影响心衰患者的预后。建立慢性心衰急性应激状态模型对研究失代偿心衰的病理生理机制及探讨治疗方案都具有重要意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 雄性Wistar大鼠48只，体重(250±10)g，购于维通利华实验动物中心，均在同一国家二级动物实验室内饲养。

　　1.2 主要仪器及试剂 阿霉素(深圳万乐药业有限公司);细菌脂多糖(Sigma公司);Trizol及RNA提取相关试剂(北京鼎国生物公司);稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂);紫外成像扫描仪及分析系统(美国BioRad公司);动物血压计(中日友好医院临床研究所)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 动物分组及药物干预 雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(n=18)和模型组(n=30)。模型组给予阿霉素腹腔注射，2.5mg/(kg·d)，每周3次，共2周，累积剂量15mg/kg;正常对照组大鼠给予等体积50g/L葡萄糖腹腔注射。继续饲养4周。处理结束后6周取样，进行各种项目的检测。

　　1.3.2 血压及心率的测定 采用尾袖法，大鼠在38℃温箱中预热15min，清醒半制动情形下测尾部血压、脉率，间隔1min测3次，取平均值。

　　1.3.3 血液动力学测定 称大鼠体重(BW)，乌拉坦1g/kg腹腔注射麻醉，背位固定，游离颈动脉，经右侧颈总动脉插管，用RM 6000生理多道仪记录颈总动脉收缩压、舒张压、左室收缩末压(LVSEP)、左室舒张末压(LVDEP) 和左室收缩与舒张末压(±LVdp/dtmax)。

　　1.3.4 心肌组织形态学观察 严格按照HE及VG染色步骤执行。应用计算机图像分析系统测定心肌胶原容积分数(CVF=胶原面积/所测视野面积)。每个样本取5张切片，每张切片随机分析5个视野。

　　1.3.5 HO1 mRNA表达的检测 分别在脂多糖(LPS)腹腔注射后即刻及6、12、24h处死大鼠，分离左心室，使用Trizol(50～100mg组织/mL )提取总RNA，逆转录合成cDNA，进行扩增。条件如下：94℃预变性2min，然后以94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 45s循环32次，72℃延伸5min。HO1：上游：5′CGAAACAAGCAGAACCCA3′，下游：5′CACCAGCAGCTCAGGATG3′，产物长度308bp;βactin：上游：5′ATCTGGCACCACACCTTC3′，下游：5′AGCCAGGTCCAGACGCA3′，产物长度192bp。琼脂糖凝胶电泳后扫描DNA条带灰度，以HO1与βactin的比值作为半定量指标。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS13.0软件包建立数据库。各组结果以±s表示，组间比较采用t检验，组内重复测量数据采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　模型组动物存活20只，死亡10只，死亡率33%。正常组大鼠腹腔注射LPS后无死亡;模型组大鼠腹腔注射LPS后死亡3只，其中2只死于注射后120min内，资料未列入统计。

　　2.1 两组大鼠血流动力学的变化 6周后模型组与正常对照组大鼠相比，心功能指标变化明显，心脏功能显著下降(P<0.05，表1)。表1 6周后两组大鼠血流动力学的变化

　　2.2 两组大鼠心肌病理形态学的分析 与正常对照组大鼠相比，模型组阿霉素腹腔注射2周后大鼠心肌发生坏死，HE染色示心肌细胞排列紊乱、大小不等、胞核着色加深;6周后模型组大鼠心肌坏死程度进一步加重(图1)。VG染色显示显著纤维化(图2)，胶原容积指数增加(3.37±0.29 vs. 2.06±0.27)。

　　2.3 内毒素作用后两组大鼠心率、血压的变化 腹腔注射LPS(0.2mg/kg)60min和120min时，与注射0min比，正常对照组大鼠仅在60min时有心率增快，而在120min时心率与注射前比无显著改变;模型组大鼠的心率在注射后60min和120min时均较注射0min显著增快，但其血压仅在注射120min后有显著下降(表2)。

　　2.4 两组大鼠心肌HO1 mRNA的表达情况 模型组心肌HO1 mRNA的表达较正常对照组明显增高。腹腔注射内毒素后，正常对照组心肌HO1表达无显著升高，而模型组心肌HO1表达在内毒素注射12h时显著升高(表3)。表2 内毒素作用后两组大鼠心率、血压的变化表3 内毒素作用后两组大鼠HO1的表达

　　3 讨 论

　　慢性心衰急性失代偿是心血管医师经常面对的问题。它不仅显著增加了心衰患者的再住院率和死亡风险，更伴随着心室重构的进一步发展，反复的失代偿形成心衰病程中的恶性循环，最终使患者走向难治性心衰和死亡[1]。

　　目前，尽管对心衰的神经体液机制和心脏重构的分子学机制已进行了深入研究，但仍有许多问题尚不明确。例如失代偿时机体发生神经体液激活的机制、细胞因子系统在心脏重构中的作用等。生物学治疗模式虽然极大地改善了心衰患者的预后，但很多时候左室重构不能得到有效逆转。因此，对于心衰失代偿这样一种病理状态还需要进行更深入的基础研究。以慢性心衰应激状态作为研究对象，有利于更进一步阐明失代偿心衰时心脏的病理生理状态、分子学机制，以及在这种病理状态下对心肌的保护。

　　本研究采用阿霉素注射制备大鼠心力衰竭模型[23]，以HO1表达程度协助提示应激反应的发生。HO1亦称热休克蛋白32，与应激密切相关。热休克、重金属、低氧、氧化剂等多种应激因素均可诱导HO1的表达，使其酶活性升高。本研究结果显示，模型组大鼠第6周时血流动力学指标恶化，与文献报道一致，并且出现心肌的坏死和纤维化。内毒素可导致心血管急性反应及心肌内TNFα等表达的增加[45]。在此基础上，我们参照正常大鼠应激模型的制备方法[67]，通过反复的预实验，最后选择LPS 0.2mg/kg腹腔注射。结果表明，LPS 0.2mg/kg腹腔注射对正常大鼠影响不显著，但可迅速导致心衰大鼠心率增快、血压下降，应激蛋白HO1表达显著增加，表现出明确的应激反应状态。

　　本研究初步建立了慢性心衰急性应激状态的大鼠模型，其操作简便，模型可靠，死亡率相对较低，可广泛应用于慢性心衰防治的基础研究。

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