通用电极内液在心肌细胞膜片钳实验中的应用

　　作者：任付先 韩振华 李忠银 王恒亮 杨宁 司定然 作者单位：(1.河南省濮阳市油田总医院心血管内科，河南 濮阳 457001;2.西安交通大学医学院附属第二医院心内科，陕西 西安 710061)

　　【摘要】 目的：探讨通用电极内液在膜片钳实验中的可行性及可靠性。方法：全细胞钳制模式下，分别应用通用电极内液、动作电位电极内液、INa及Ito专用电极内液记录家兔心室肌细胞动作电位、钠通道及Ito动力学参数，比较应用不同电极内液时所得各组参数的差异。结果：应用通用电极内液与动作电位电极内液、INa及Ito专用电极内液记录所得之动作电位、钠通道及Ito动力学各参数无显著差异，P值均>0.05。结论：膜片钳实验中应用通用电极内液记录不同离子通道的动力学参数是可行及可靠的。

　　【关键词】 肌细胞/心脏;细胞膜;电生理技术/心脏;电极内液;膜片钳术;INa;Ito;离子通道

　　Application of General Pippette Solution in Patchclamp Study on Rabbit Cardiomyocytes

　　REN Fuxian1,HAN Zhenhua2,LI Zhongyin1,et al

　　(1.Department of Cardiology,Puyang Oilfield General Hospital,Puyang,457001,Henan,China;

　　2.Department of Cardiology,The Second Affiliated Hospital Medical College，

　　Xian Jiaotong University,Xian,710004,Shanxi,China)

　　【ABSTRACT】 Objective:To testify the feasibility and reliability of modified general pippette solution in wholecell patchclamp study.Methods:The action potential(AP),INa and Ito dynamic parameters were recorded and compared in wholecell patch clamp model by modified general pippette solution and specified AP,INa and Ito pippette solution respectively.Results:AP,INa and Ito dynamc parameters measured by general pippette solution,AP and current specified pippette solutions were not significantly different(All P>0.05).Conclusion:Application of the modified general pippette solution in measrement of different parameters from each ion channel is feasible and reliable.

　　【KEY WORDS】 Myocytes/Cardiac,Cell Membrane,Electrophysiologic Techniques/Cardiac,Pippette Solution,PatchClamp Techniques,INa,Ito,Ion Channel

　　电极内液是心肌细胞膜片钳实验中重要的液体之一，通常情况下其成分随待测指标的不同而不同。然而，为保持实验数据的连续性和可靠性，有时需要在同一细胞上记录动作电位及不同的离子电流，或者同一离子通道的不同动力学参数。如果每次实验均采用不同的电极内液，则必须对新的细胞重新进行封接。由于所采集的数据来源于不同的细胞，增加了不同组别数据之间的误差，进而影响实验结果的可靠性。本研究旨在测试通用电极内液的稳定性，为使用单一电极内液连续记录实验数据提供可靠依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 电极内液

　　1.1.1 通用电极内液(mmol/L) 135.0KCl(天津泰兴试剂厂)、1.5MgCl2(天津泰兴试剂厂)、10.0HEPES(Sigma，USA)、5.0EGTA[中国医药(集团)上海化学试剂公司]、5.0K2ATP(Sigma，USA)，用KOH将pH调至7.2。

　　1.1.2 动作电位电极内液[1](mmol/L) 140.0KCl、2.0Na2ATP(Sigma，USA)、1.0MgCl2、10.0EGTA、5.0HEPES，用KOH将pH调至7.2。

　　1.1.3 Na电流专用电极内液[2](mmol/L) 120.0potassium aspartate(Sigma，USA)、10.0KCl、10.0NaCl、0.4CaCl2、2.0MgCl2、10.0HEPES及1.0EGTA,用KOH将pH调至7.2。

　　1.1.4 Ito电极内液[3](mmol/L) 140.0KCl、1.0MgCl2、5.0HEPES、1.54CaCl2、5.0EGTA、5.0Na2ATP,用KOH调pH至7.0。

　　1.2 配制 用精度为0.0001g的电子天平精确称量上述各成份，并分别将称量好的化学制剂放入洁净的200mL各烧杯中。用100mL量筒称量双蒸水100mL分别倒入上述烧杯中，加入洁净的磁力搅拌子，放在磁力搅拌器上搅拌至溶质完全融化，并用1mol/L的KOH液滴定至pH7.2。双蒸水、电子天平(Mettler，Switzerland)及酸度计(Mettler，Switzerland)均由西安交通大学生物医学实验中心提供。

　　1.3 细胞分离及保存 采用以往报道的方法分离单个心肌细胞[4，5]。选用体重为1.5～2.0kg、月龄3～4个月的健康家兔，经Longandorff灌流装置双酶解法主动脉逆行灌流家兔心脏，取2cm×2cm右室游离壁心肌组织，于KB液[6](mmol/L：25KCl，10KH2PO4，Taurine 20，3MgCl2，70Glutamate acid，10HEPES，10Glucose，0.5EGTA;1mol/L的KOH液将pH调至7.35)中剪碎，200μm筛网过滤，获取家兔单个心室肌细胞，保存备用。电生理实验前2h分两步用台氏液(mmol/L：135.0NaCl,11.9NaHCO3,5.4KCl,1.8CaCl2,1.0MgCl2,0.33NaH2PO4,10.0HEPES,10.0Glucose;1mol/L的NaOH将pH调至7.35±0.05)复钙，静置30min后开始下一步实验。

　　1.4 电生理实验方法

　　1.4.1 细胞的选取 将充分复钙后的细胞悬液2～3滴滴入充满台氏液的细胞灌流池中，静置30min，使细胞充分贴壁。充氧台氏液3mL/min恒速灌流，冲去细胞碎片。选取贴壁完全、胞膜完整、横纹清晰、静止不动的心室肌细胞，在室温下(20～22℃)进行实验。

　　图1 家兔心脏右心室肌细胞1.4.2 改良Hamill法[7]建立全细胞记录模式 用水平式电极拉制仪(Sutter，USA)将充分预处理的国产玻璃微管毛坯拉制成两根相同的玻璃微电极，并充灌配制好的电极内液，使其阻抗值在2.5～4.0MΩ之间。操纵微电机使玻璃微电极置于心肌细胞表面，给以负压吸引，使其与心肌胞膜紧密接触。当封接阻抗达1GΩ以上时，继续给予负压吸引，使细胞膜破裂，电极内液和细胞内液交通，破膜后封接阻抗稳定在1GΩ以上，形成全细胞记录模式(whole cell patch clamp)(图1)。补偿膜电容电流和串联阻抗，保持基线平稳，进行下一步实验。

　　1.5 图像处理及统计学方法

　　应用PClamp 8.1(Axon,American)软件包通过数模/模数(AD/DA)转换板支持的膜片钳放大器(Digidata 1200,Axon,USA)发放刺激信号、采集相关数据，并存储于计算机硬盘，联合应用Clampfit和Clampex分析数据，并生成相关图表。相关数据采用(x±s)表示，两均数比较采用t检验，P<0.05为具有统计学差异。

　　2 结果

　　2.1 动作电位 将膜片钳放大器置于电流钳制模式，按预设动作电位刺激程式，刺激并记录家兔心室肌细胞的动作电位。结果显示，使用动作电位专用电极内液及通用电极内液记录到的静息电位水平分别为(-82.18±1.32)mV、(-83.01±1.41)mV(P>0.05);动作电位时程分别为(325.16±21.33)ms、(327.22±20.01)ms(P>0.05);动作电位幅值分别为(92.23±2.21)mV、(95.07±2.16)mV(P>0.05)(图2)，两组数据间均无明显差异。

　　图2 在Tyrode液中记录到的家兔右心室肌细胞动作电位图形

　　A 使用动作电位专用电极内液记录的图形;B 使用通用电极内液记录的图形;C 动作电位刺激程式。2.2 钠通道动力学 按图示程式在电压钳制模式下记录心室肌细胞的钠电流电压关系曲线及钠通道失活后恢复曲线。结果提示，在专用细胞外液[8]中分别应用钠电流专用电极内液及通用电极内液记录到的心室肌细胞最大电流密度分别为(-66.11±10.03)pA·pF-1和(-67.02±9.32)pA·pF-1(P>0.05)(图3);失活后恢复时间常数分别为(101.18±26.27)ms和(103.34±25.17)ms(P>0.05)(图4)，两组数据间均无明显差异。

　　2.3 Ito电压电流关系曲线

　　根据预设刺激程序刺激心室肌细胞，记录到瞬时外向电流曲线如图5所示。利用Ito专用电极内液及通用电极内液记录到心室肌细胞Ito电流密度分别为(8.12±0.46)pA·pF-1和(8.12±0.46)pA·pF-1(P>0.05)，两组数据间均无明显差异。

　　3 讨论

　　膜片钳实验是研究各类可兴奋细胞电生理学特性图3 家兔右心室肌细胞钠电流ⅠⅤ曲线

　　A 记录自INa专用电极内液;B 记录自通用电极内液;上图为INa电流电压关系曲线刺激程式。图4 家兔右心室肌细胞钠通道失活后恢复曲线

　　A 记录自INa专用电极内液;B 记录自通用电极内液;上图为INa失活后恢复刺激程式。图5 家兔右心室肌细胞Ito之ⅠⅤ曲线

　　A 记录自Ito专用电极内液;B 记录自通用电极内液;上图为Ito电流电压关系曲线刺激程式。的最先进的技术方法之一。自Erwin Neher[9]于1976年创立、并于1981年由Hamill[7]加以改进以来，已广泛应用于各种离子通道的研究中。利用该技术不但可在全细胞模式下记录细胞的动作电位及各种离子通道的动力学，而且可在一小块细胞膜上对不同的离子通道进行研究，如通道分布的密度、开放概率等。

　　实验过程中，受试细胞一般浸于灌流池中类细胞外液或灌流液中，而玻璃微电极则位于细胞表面或者与细胞内液相交通，并与置于灌流池中的参考电极构成回路。通常情况下，用来记录动作电位的电极内液成份与记录INa、IK和ICa的电极内液有很大差别。因此，同时获得同一细胞的动作电位、INa、IK和ICa通道的动力学参数是不可能的。因此，需要一种可记录所有离子通道电流特征和动作电位的通用电极内液，以保持实验数据的连续性及可靠性。1988年Giles 和Imaizumi[10]曾使用了同一种电极内液[mmol/L：120.0potassium aspirate,30.0KCl,2.0adenosine5′triphosphorate,4.0NaCl，1.0MgCl2,5.0HEPES,1.0EGTA,pH7.2]记录家兔心室肌细胞动作电位和延迟整流钾电流动力学，并取得了稳定的实验结果，但尚未见通用于记录细胞动作电位和钠通道动力学及Ito的电极内液。

　　我们使用改良型通用电极内液记录了家兔心室肌细胞动作电位、钠通道及Ito动力学参数。在全细胞记录模式建立后，首先在电流钳制下记录心室肌细胞的动作电位，而后通过PClamp8.1软件中Clampex的Lab bench改变钳制模式，在特定的钳制电压下获得稳定的钠通道及Ito动力学参数。所得图像稳定，各组参数相比无统计学差异。由于所有数据均来自同一个细胞，与采用不同电极内液分别记录的不同细胞动作电位和动力学参数均值相比，其可靠性得到了极大提高。同时，使用同一种内液，避免了实验中反复封接细胞，节省大量时间，从而可极大地提高实验效率。因此，膜片钳实验中应用通用电极内液记录不同离子通道的动力学参数是可行及可靠的。

　　【参考文献】

　　1 丁怀玉，杨新春，刘秀兰,等.兔肺静脉肌袖心肌细胞动作电位的特性和一些离子流机制[J].生理学报,2006,58(2):129135

　　2 Mirko B，Dario D，Richard BR. Na+ current contribution to the diastolic depolarization in newborn rabbit SA node cells[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2000,279:23032309

　　3 Yehia AR,Shrier A,Lo KC,et al.Transient outward current contributes to Wenckebachlike rhythms in isolated rabbit ventricular cells[J].Am J Physiol,1997,273(42):111

　　4 Ren FX,Niu XL,Ou Y,et al. Morphological and electrophysiological properties of single myocardial cells in koch triangle of rabbit heart[J]. Chinese Med JPeking, 2006,119(24):20752084

　　5 任付先，牛小麟,韩振华 等.交界区逸搏节律的细胞及电生理 学基础[J].西安交通大学学报(医学版),2009,30(2):149153

　　6 Gerrit I,Udo K.Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a“KB Medium”[J]. Pflǘgers Achiv,1982,395:68

　　7 Hamill OP,Neher ME,Sakmann B,et al. Improved patchclamp technique for high resolution current recording from cells and cell free membrane patches[J]. Pflugers Archiv,1981,391:85100

　　8 Ren FX,Niu XL,Ou Y,et al. Sodium current kinetics of transitional myocytes in koch triangle of rabbit hearts[J]. Chinese Med JPeking,2008,121(21):21852191

　　9 Neher E,Sakmann B.Singlechannel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibers[J]. Nature,1976,260:799802

　　10Giles WR,Imaizumi Y.Comparison of potassium currents in rabbit atrial and ventricular cells[J]. J Physiol,1988,405:123145