丹参多酚酸盐对氧化低密度脂蛋白促血管平滑肌细胞分泌作用的影响

　　作者：吴兴利,高玉玲,李金珉，杨丁友,朱梅，陈琪，李德印，王士雯 作者单位：(中国人民解放军总医院 老年心血管疾病研究所,北京 100853)

　　【摘要】 目的:研究丹参多酚酸盐对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)致兔血管平滑肌细胞(VSMC)分泌细胞因子的影响。方法:兔VSMC分5组处理,即对照组、oxLDL(50 mg·L-1)组和不同浓度丹参多酚酸盐(10、50、100 mg·L-1)加oxLDL(50 mg·L-1)组。以酶联免疫吸附法检测培养上清液中细胞因子白细胞介素18(IL18)、白细胞介素1(IL1)以及可溶性细胞间黏附分子(ICAM1)水平。结果:oxLDL(50 mg·L-1)可促进VSMC分泌IL18、IL1和ICAM1,于作用后8 h分别增至对照组的1.7、3.2和2.1倍,与对照组比较均有非常显著差异(均P<0.01)。丹参多酚酸盐可浓度依赖地抑制oxLDL的促IL1和ICAM1分泌作用(P<0.05)，在50～100 mg·L-1浓度范围内对IL18的产生具有抑制作用(P<0.05)。结论:oxLDL可促进兔VSMC分泌细胞因子IL18、IL1及ICAM1。丹参多酚酸盐可能通过抑制oxLDL刺激的细胞因子分泌对VSMC免疫学功能发挥调控效用。

　　【关键词】 氧化低密度脂蛋白; 丹参多酚酸盐; 血管平滑肌细胞; 细胞因子

　　Effects of salvianolate on secreting function stimulated by oxidized

　　low density lipoprotein in vascular smooth muscle cells

　　WU Xingli, GAO Yuling, LI Jinmin， YANG Dingyou, ZHU Mei, CHEN Qi,

　　LI Deyin, WANG Shiwen(Institute of Geriatric Cardiology, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China)

　　[Abstract] Objective: To investigate the effects of oxidized low density lipoprotein(oxLDL) on cytokins secretion of rabbit vascular smooth muscle cells(VSMCs) and the intervention effect of salvianolate. Methods: Rabbit VSMCs were cultured and divided in to five groups: the contorl group, oxLDL(50 mg·L- 1) group， different concentrations of salvianolate(10, 50, 100 mg·L- 1) plus oxLDL(50 mg·L- 1) group. The levels of interleukin18( IL18 ), interleukin1( IL1) and intercellular adhesion molecular(ICAM1) were evaluated by ELISA method. Results: oxLDL increased the secretion of IL18, IL1 and ICAM1 by 1.7, 3.2 and 2.1 fold respectively compared with th control group(P<0.01). Salvianolate decreased the secretion of IL1 and ICAM1 significantly in a concentration dependent modality(P<0.05). The inhibiting effect on the secretion of IL18 can be found when treated with 50 mg·L-1 and 100 mg·L- 1 of salvianolate(P<0.05). Conclusion: oxLDL can increase the secretion of IL18， IL1 and ICAM1 in rabbit VSMCs. Salvianolate may regulate the immunological function of VSMCs by inhibiting the secretion of abovementioned cytokins stimulated by oxLDL.

　　[Key words] oxidized low density lipoprotein; salvianolate; vascular smooth muscle cells; cytokins

　　动脉粥样硬化(AS)是多细胞、多因子参与的以血管平滑肌细胞(VSMC)生物学活性改变为主要病理改变的动脉壁炎性病变[1-2]。VSMC在氧化低密度脂蛋白(oxLDL)的调节下发生表型改变,分泌若干细胞因子，继而促发免疫病理学反应，最终导致AS的发生与进展[3-4]。丹参多酚酸盐为丹参最重要的药理学有效成分[5]。近年研究显示,其具有多重明显心血管保护作用，但是有关其分子机制，尤其对VSMC分泌白细胞介素18(IL18)、白细胞介素1(IL1)以及细胞间黏附分子1(ICAM1)等致AS炎性因子的影响尚未充分阐明。本研究拟对其进行同步研究，为临床应用提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂和材料

　　改良伊格培养液(DMEM)、胰蛋白酶(GIBCO公司),加强型小牛血清(Hyclone公司),丹参多酚酸盐(上海绿谷制药有限公司,产品批号70802),IL18、IL1和ICAM1 ELISA试剂盒(购自武汉博士德生物公司)。

　　1.2 细胞培养

　　采用贴块法培养兔VSMC[4],实验用第5～10代细胞。

　　1.3 实验分组

　　VSMC分5组处理,即对照组、oxLDL(50 mg·L-1)组、不同浓度丹参多酚酸盐(10、50、100 mg·L-1)加oxLDL(50 mg·L-1)组。细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养至融和后,换无血清培养液继续培养24 h,然后换兔血清DMEM培养液,同时分组并加入oxLDL(50 mg·L-1)培养8 h,或加入各浓度的丹参多酚酸盐(10、50、100 mg·L-1)加oxLDL(50 mg·L-1)培养8 h,对照组仅用兔血清培养液培养8 h。

　　1.4 细胞因子测定

　　细胞培养至各指定时间后,收集培养液,采用酶联免疫吸附法测定培养上清液IL18、IL1和ICAM1含量。

　　1.5 统计学处理

　　数据以±s表示,应用SPSS 13.0进行统计学处理。组间比较采用方差分析，多重比较用SNK法,显著性水平为α=0.05。

　　2 结 果

　　oxLDL(50 mg·L-1)可促进VSMC分泌IL18、IL1和ICAM1,8 h分泌量分别增至对照组的1.7、3.2和2.1倍,与对照组比较均有非常显著意义(均P<0.01)。丹参多酚酸盐可浓度依赖地抑制oxLDL的促IL1和ICAM1分泌作用，丹参多酚酸盐仅在50～100 mg·L-1浓度范围内对IL18的产生具有抑制作用。见表1。表1 丹参多酚酸盐对VSMC分泌细胞因子的影响与空白对照组比较，a P<0.01;与oxLDL组比较，b P<0.05，c P<0.01

　　3 讨 论

　　基础研究证实，AS是动脉壁的免疫病理性炎症，oxLDL是强力的致AS因子，它可以显著增加炎症细胞因子如肿瘤坏死因子、IL6，IL8等的表达，从而促进AS的发生发展[1-4]。深入阐明oxLDL的作用机制,尤其是对其他细胞因子的影响一直是AS防治研究的热点。

　　IL18是一种“多效能”的细胞因子，其在AS斑块中以及在冠心病患者血液中的高水平表达已经引起学者们的关注[6-9]。IL18能够直接或通过诱导巨噬细胞等产生干扰素γ(IFNγ)，促进单核巨噬细胞及VSMC等表达基质金属蛋白酶(MMPs),后者促进斑块破裂。IL18还可以诱导血管壁细胞表达IL1β、黏附分子，促使VSMC吞噬oxLDL。以上研究结果均支持IL18参与AS的形成与进展。本实验显示oxLDL使VSMC分泌IL18增加1.7倍，提示增加IL18表达可能是oxLDL致AS的另一重要途径。

　　现已明确多种因素包括细胞因子IL18、促有丝分裂因子等可促使VSMC表达IL1。IL1具有多种生物学功能,它作用于血管内皮细胞、VSMC、单核细胞和中性粒细胞等，诱导ICAM1、单核细胞趋化蛋白1、IL1、TNFα的表达,增加炎症细胞对VSMC的黏附，促进VSMC增生，参与AS的形成[10-14]。本实验结果提示，oxLDL对VSMC分泌IL1的效用比IL18更明显，较对照组增加达3.2倍，其对IL1表达的增加可能有助于解释oxLDL的强力致AS作用。

　　ICAM1是免疫球蛋白超家族的成员之一,广泛表达于动脉内皮细胞及平滑肌细胞[15-16],它通过与其配体和巨噬细胞抗原复合体1相结合,介导白细胞与内皮细胞的黏附、迁移与转化。sICAM1是ICAM1的可溶形式,由蛋白酶裂解使后者的胞外成分脱落而来,基本反映与膜结合的ICAM1的表达情况。多项临床研究发现,sICAM1与AS程度及冠心病高危事件显著相关[17-19]。本实验显示,与IL1相比，oxLDL刺激VSMC分泌ICAM1的能力虽然较弱(仅达2.1倍)，但仍然有显著性升高，提示oxLDL确是一多效性致AS因子。

　　因此，开发对oxLDL具有较全面调节作用的药物可能会成为AS防治研究的发展方向之一。丹参多酚酸盐是中药丹参主要活性成分，近年基础研究显示,其在防治AS、减轻心脏缺血再灌注损伤、降低心脏耗氧量、抑制血小板聚集和防治血栓形成等方面具有明显的作用，临床上也已经应用于冠心病的治疗[5]。丹参多酚酸盐作用机制涉及清除自由基、降低细胞内胆固醇合成、提高内皮细胞抗氧化酶活力以及抑制某些细胞因子的分泌等[20]。本研究结果显示,经丹参多酚酸盐作用后，oxLDL的促IL18、IL1及ICAM1分泌作用明显下降，并且随药物浓度增加此作用愈明显,说明丹参多酚酸盐的心血管保护作用可能与其有力的抗炎性细胞因子分泌作用有关。

　　综上所述,oxLDL的强烈致AS作用可能与其促进VSMC分泌IL18、IL1及ICAM1等多功能炎症因子有关,丹参多酚酸盐通过抑制上述及其他多种细胞因子的产生,较全面调控AS发生发展，达到抗AS效用。此将有助于推进oxLDL致AS分子机制研究，并为以丹参多酚酸盐为代表的中药防治AS研究提供新的思路与理论支持。

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